雌激素受體基因多態性、膳食大豆攝入與乳腺癌患病風險的關系

陶 蘋，余曉紅，劉 莉，王 瓊，齊亞娜，李 卉△，李佳圓

(1．四川省腫瘤醫院乳腺外科，成都610041;2．成都市婦女兒童中心醫院體檢科，成都610041;3．成都市婦女兒童中心醫院婦女保健中心，成都610041;4．四川大學華西公共衛生學院，流行病與衛生統計學系，成都610041)

人類正常乳腺組織雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)過度表達可能會增加乳腺癌發生風險。XbaⅠ(rs9340799)是人群研究較為關注的ERα基因多態性位點。該位點位于ERα基因(人類染色體6q25．1)第1內含子內，于第2外顯子上游351bp處發生A→G(x→X)基因突變［1］。該突變可能會影響正常乳腺組織ERα基因某些區域外顯子的選擇性剪接，從而降低ERα蛋白的表達活性［2］。此外，研究發現不同劑量的大豆異黃酮對正常乳腺組織ERα表達具有不同方向的調節作用［3-4］。本課題開展基因-環境交互作用研究，探討雌激素受體α基因XbaⅠ酶切片段多態性(簡稱:XbaⅠ多態性)、膳食大豆攝入與乳腺癌風險的關系。

1 材料與方法

1．1 研究對象

2010年7月至2012年6月序貫收集來源于四川省腫瘤醫院經組織病理學診斷的原發性乳腺癌新發病例。對照組來源于成都市婦女兒童醫學中心的健康體檢女性。病例對照年齡30～70歲，均居住于四川省10年以上者。病例排除轉移性乳腺癌患者，精神疾病及其它內分泌疾病患者。對照排除放射線等職業暴露史、惡性腫瘤、內分泌疾病、生殖系統疾病以及精神疾病患者。調查對象均簽署知情同意書。

1．2 研究方法

1．2．1 樣本量計算 樣本量計算采用QUANTO(1．2．4版)專用軟件(美國南加利福尼亞大學開發)估計基因-環境交互作用樣本量，參數設定如下:(1)檢驗水準和檢驗效能:雙側α=0．05，檢驗效能為0．8;(2)等位基因頻率:參照文獻，漢族女性XbaⅠ野生等位基因攜帶率為71．1%［5］;(3)環境因素暴露率:根據課題組前期研究結果，膳食大豆高攝入比例約為45．5%［6］;(4)基因主效應(G)、環境主效應(E)及交互效應(G-E):由于XbaⅠ人群研究結論尚不一致，采用ORg=1．0;根據本課題組前期研究結果，取 ORe=0．50［6］;交互效應 OReg在0．20～0．40間變化時，研究所需病例對照樣本量在124～281對之間變化。本次研究最終收集樣本量為病例對照各291例。

1．2．2 調查方法 現場調查采用問卷收集研究對象一般人口學特征、女性月經史、生育史、吸煙、飲酒、乳腺癌家族史、乳腺良性疾病史等信息。采用頻數調查和單次攝入量調查結合的方法，調查研究對象最近五年的常見大豆類食物攝入情況。隨機抽取5%研究對象于調查兩周后重新進行問卷復核，兩次回答一致率為90%。

1．2．3 基因型檢測 基因型檢測采用EDTA抗凝管收集研究對象的外周靜脈血5ml，-20℃保存。采用天根生化科技(北京)有限公司全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。采用限制性片段長度多態性技術檢測XbaⅠ(rs9340799)基因多態性。目的基因擴增采用巢式 PCR技術，利用Primer Premier5．0引物設計軟件設計PCR引物。外側引物:上游5’-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3’;下游 5’-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTAT-CTGA-3’。內側引物:上游5’-AGGCTGGGCTCAAACTACAG-3’，下游 5’-CTCTGGGAGATGCAGCAGAT-3’。采用北京康為世紀生物科技有限公司XbaⅠ內切酶(1U/μl)對目的位點進行酶切，酶切產物進行凝膠電泳，于凝膠成像系統紫外燈下觀察酶切結果。如圖1所示，僅出現一條316bp條帶，為野生純合型(xx);存在615bp和316bp兩條帶，為突變雜合型(Xx);僅出現一條615bp條帶，為突變純合型(XX)。隨機抽取10%的樣本進行基因型重復檢測，重測結果一致率為100%。

圖1 XbaⅠ多態性位點電泳圖

1．3 統計分析

2 結果

2．1 乳腺癌危險因素病例及對照組間比較

本研究病例組和對照組平均年齡分別為48．00±10．96 歲和47．64 ±8．90歲，差異無統計學意義(t=-1．65，P＞0．05)?？側巳杭敖^經前后亞組危險因素篩選結果詳見表1，總人群中，文化程度、家庭人均月收入、月經狀態、體質指數(body mass index，BMI)、初潮年齡、初產年齡、活產次數、哺乳情況在病例及對照組間分布差異有統計學意義(P＜0．05)。絕經前女性中，文化程度、家庭人均月收入、初潮年齡、初產年齡、活產次數、哺乳情況在組間分布差意義異有統計學(P＜0．05)。絕經后女性中，文化程度、家庭人均月收入、BMI、初產年齡、活產次數、哺乳時間、是否服用雌激素存在組間分布差異(P ＜0．05)。

表1 乳腺癌常見危險因素變量篩選結果

2．2 XbaⅠ多態性主效應

總人群中，對照組 x等位基因攜帶率為78．2%。對照組XbaⅠ位點基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(XbaⅠ:χ2=0．001，P=0．98)。在總人群、絕經前及絕經后女性中，XbaⅠ基因型分布與乳腺癌患病風險間無統計學關聯(Xx vs．xx:OR=0．61～0．82;XX vs．xx:OR=0．60～3．62;Xx+XX vs．xx:OR=0．61～0．92，95%CI均包括1)。見表2。

2．3 膳食大豆主效應

總人群中病例組DISI攝入量中位數為7．36 mg/d(QU-QL=14．42 mg/d);對照組 DISI攝入量中位數為 9．62 mg/d(QU-QL=12．84 mg/d)?？側巳汉徒^經后人群中，DISI攝入量與乳腺癌患病風險呈負相關(總人群:OR=0．64，95%CI:0．42～0．97;絕經后:OR=0．40，95%CI:0．19～0．81)。但在絕經前人群中未發現二者的關系。見表2。

表2 XbaⅠ多態性、膳食大豆攝入與乳腺癌風險的關系

表3 XbaⅠ多態性和膳食大豆攝入的聯合效應

2．4 XbaⅠ多態性和膳食大豆的協同效應

總人群中，與xx野生基因型相比，攜帶X突變等位基因的女性乳腺癌患病風險無明顯變化;DISI高攝入組乳腺癌患病風險有所降低(OR=0．60，95%CI:0．36～1．01);攜帶 X等位基因同時 DISI高攝入女性乳腺癌風險進一步降低(OR=0．47，95%CI:0．25～0．89)。相乘交互系數 IOR 為1．15(0．49～2．76)。相加交互系數 RERI為 0．19(-0．35～0．73)、API為 0．41(-0．75～1．57)、S 為0．73(0．34～1．59)見表 3。亞組分析未發現 XbaⅠ多態性與膳食大豆的協同作用。

3 討論

雌激素受體XbaⅠ位點是人群研究較為關注的雌激素受體易感基因多態性位點。Maruyama等［2］的體外試驗發現攜帶x等位基因的ERα表達活性增高。但本研究尚未觀察到XbaⅠ多態性與乳腺癌患病風險的關系。這與此前國內外部分人群研究結論一致。但來自中國、韓國和挪威的人群研究發現攜帶X等位基因可降低乳腺癌患病風險［5，11-12］。研究間結論不一致的原因可能與研究間樣本量差異、各研究人群代表性有關。但總的說來，目前大部分研究報道的XbaⅠ的風險效應較弱(OR＜2，OR 95%CI下限接近1)，說明其對乳腺癌風險的貢獻較小。

大豆異黃酮對ERα表達的調節比較復雜。Wood［3］等發現高劑量服用大豆異黃酮(240mg/d)的卵巢切除的雌性哺乳動物，乳腺組織ERα活性標記物pS2表達量明顯降低。但有體外試驗發現，大豆異黃酮中主要成分之一染料木苷低濃度即可誘導人和嚙齒類動物的上皮細胞ERα表達，刺激細胞生長［4］。本研究發現中國女性膳食大豆攝入對乳腺癌患病風險呈保護作用，尤其在絕經后女性中更為明顯。該研究結果與多項人群研究結論一致。最近一項大樣本Meta分析［13］顯示，亞洲女性膳食大豆攝入可明顯降低其乳腺癌患病風險(合并OR=0．86，95%CI:0．77-0．95)，且對絕經后女性具有更明顯的保護作用。

由于基礎研究發現XbaⅠ多態性、大豆異黃酮攝入可能會通過影響乳腺組織ERα表達水平從而影響乳腺細胞增殖，因此推測XbaⅠ多態性、膳食豆類攝入在影響乳腺癌患病風險上可能存在共同的作用環節，進而可能存在生物學交互作用。本研究采用分層分析估計XbaⅠ多態性、膳食大豆的統計學交互作用。結果顯示總人群中，既攜帶X等位基因又膳食大豆高攝入的女性乳腺癌患病風險明顯降低，其風險降低程度明顯低于僅X等位基因暴露組和僅膳食大豆高攝入組，這提示二者可能存在相乘模式下的交互作用，且作用模式符合超相乘作用(RR11＞RR01×RR10)。但 Logistic回歸顯示相乘交互作用系數IOR無統計學意義。此外，本研究發現相加交互系數也均無統計學意義。因此，根據本研究結果，尚不能認為XbaⅠ多態性、膳食大豆攝入存在生物學交互作用。目前，關于XbaⅠ多態性、膳食豆類攝入對乳腺癌風險影響的機制研究尚不成熟，后續深入的機制研究將有助于理解兩者之間是否存在生物學交互效應及效應特點。此外，本次研究結果也不排除由于兩者交互作用歸因危險度較小，且本次研究樣本量較局限，因此尚未觀察到統計學交互效應。后續研究將擴大樣本量進一步探討二者的交互作用。

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