肝外膽管癌患者膽汁上清液及沉淀物中K-ras、p53基因突變檢測及意義

張雙霞，張國梁，鮑文漪

(天津市第一中心醫院，天津300192)

膽管癌早期診斷困難，預后差，近年來其發病率呈不斷上升趨勢。其中肝外膽管癌約占膽管癌的80%～90%，影像學上主要表現為膽管狹窄，與膽管良性狹窄的鑒別困難［1］。膽管癌惡性程度高，手術切除是惟一有效的治療方法;膽管良性狹窄多可通過內科方法治療，如內鏡下支架植入等。因此，兩者準確鑒別對患者治療方案的制定及預后判斷均有重要意義。目前，膽管癌的診斷主要依賴于影像學、細胞學及生物化學方法的聯合應用，但敏感性和特異性均不高。K-ras基因和p53基因突變在消化道腫瘤中的研究較多，但其在膽汁標本中的研究少見。本研究檢測肝外膽管癌患者膽汁上清液及沉淀物中K-ras、p53基因突變情況，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年8月～2013年8月天津市第一中心醫院診治的肝外膽管癌患者57例(膽管癌組)。其中，男32例、女25例，年齡39～81(59.9±7.9)歲。均經手術病理、膽管刷片或膽汁細胞學檢查確診。UICC分期［2］為Ⅰ～Ⅱ期21例、Ⅲ～Ⅳ期36例，腫瘤位于膽管上段25例(肝門部)、中段19例、下段13例。排除肝內型(周圍型)膽管癌。選取同期膽管良性狹窄患者42例(良性狹窄組)，男27例、女17例，年齡27～77(56.7±6.3)歲，其中膽管結石合并膽管炎性狹窄21例、膽囊切除術后膽管狹窄7例、慢性胰腺炎胰頭纖維化腫大壓迫胰腺段膽總管5例、硬化性膽管炎3例、膽管良性腫瘤3例、膽總管囊腫2例、Mirrizi綜合征膽管狹窄1例。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 膽汁中K-ras、p53基因突變檢測 兩組術前均進行經內鏡逆行性胰膽管造影(ERCP):患者均取左側臥位或俯臥位，將電子十二指腸鏡(Olympus JF-40)插至十二指腸降部，拉直鏡身，擺正乳頭位置，選擇性膽管插管;插管成功后，于狹窄近端抽取膽汁約10 mL，4 h內3 000 r/min離心10 min，分別取膽汁上清液和沉淀物200 μL，置于1.5 mL離心管中，加入 20 μL QIAGEN 蛋白酶及 200 μL緩沖液，置于55℃水浴中消化12 h，取出振蕩，100℃保溫8 min后振蕩，13 000 r/min離心5 min，取上清液作為PCR模板。根據Gene Bank提供的序列分別選擇 p53 易突變外顯子 5、6、7、8，K-ras基因外顯子1設計相應的引物，引物序列及擴增片段長度見表1。PCR反應總體積均為25 μL;反應條件均為94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、52 ℃ 1 min、74 ℃ 1 min，40個循環;74℃延伸10 min。取PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統分析并拍照，以確定PCR產物。另取PCR產物，采用95%甲酰胺于85℃加熱變性15 min，冰浴，上樣于12%的聚丙烯酰胺凝膠，在4℃恒壓150 V條件下電泳約8 h，結束后進行SSCP銀染色，雙蒸水漂洗，顯影液顯色，加入固定液終止反應，分析PCR產物基因突變情況。SSCP銀染色異常電泳帶(突變)表現為條帶異常涌動、條帶增加或缺失。p53的4個外顯子均為正常者判定為野生型，4個外顯子中有1個存在突變者判定為突變型。

表1 引物序列

1.3 K-ras、p53突變基因的DNA純化和測序 對PCR產物進行DNA純化和測序，由上海英駿生物技術有限公司完成，以進一步明確經PCR擴增的K-ras和p53基因片段堿基序列突變情況及其突變序列。

1.4 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件。計量資料以±s表示，比較采用t檢驗;計數資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 K-ras、p53基因突變情況 ① K-ras基因突變情況:良性狹窄組膽汁標本中未發現K-ras基因突變。膽管癌組膽汁標本中K-ras基因突變率為77.19%(44/57);其中上清液為 66.67%(38/57)，沉淀物為59.65%(34/57)，兩者比較 P ＞0.05;44例K-ras基因突變陽性標本中，10例只在上清液中發現K-ras基因突變，6例只在沉淀物中發現K-ras基因突變，28例上清液和沉淀物中均發現K-ras基因突變。②p53基因突變情況:良性狹窄組膽汁上清液及沉淀物標本均未檢出p53基因突變。膽管癌組40例患者膽汁SSCP染色提示有p53基因突變，其中第5外顯子突變4例、第6外顯子突變7例、第7外顯子突變6例、第8外顯子突變23例，陽性率為 70.18%(40/57);其中上清液為 63.16%(36/57)，沉淀物為 45.61%(26/57)，兩者比較 P＜0.05。40例p53基因突變陽性標本中，14例只在上清液中發現基因突變，4例只在沉淀物中發現基因突變，22例上清液和沉淀物中均發現基因突變。見表2。③聯合檢測膽管癌患者膽汁上清液和沉淀物中p53基因和K-ras基因突變率(一種基因突變即記為突變)為85.97%(49/57)。

表2 兩組膽汁上清液和沉淀物中K-ras、p53基因突變情況［例(%)］

2.2 膽管癌組K-ras、p53突變基因的DNA測序經DNA測序分析顯示，突變型K-ras基因突變第1外顯子和p53第5、6、7、8外顯子堿基序列的改變均與PCR-SSCP陽性條帶數一致;同一病例膽汁上清液和沉淀物中PCR-SSCP陽性條帶、堿基序列的改變均一致。膽管癌組K-ras基因突變發生于第12密碼子42例，發生于第6和第36密碼子2例;其突變方式以GGT→GAT和GGT→GCT最多，亦有GGT→GTT、AGT→TGT;絕大多數為點突變，2例為插入突變。40例患者p53基因突變，均證實有DNA堿基改變，基因突變形式有多種，有多個突變位點，但大多數突變類型為 G→A和 T→C，如 codon 202(CGT→CAT)、codon 248(CGG→CAG、TGG→CGG)、codon 175(CGC→CAC)、codon 245(GGC→AGC、GGC→GCC)、codon 249(AGG→AAG)、codon 273(TTG→CTG)等。

3 討論

膽管癌發病隱匿，惡性程度高，一旦發現多為晚期，手術切除率低，預后差［3，4］。肝外膽管癌在影像學上主要表現為膽管狹窄，其診斷主要依賴于臨床表現與影像學檢查。盡管大部分膽管狹窄屬于惡性病變，但膽管炎癥、損傷、畸形、結石、結核、硬化性膽管炎等良性狹窄占膽管狹窄的30%，與膽管癌有相同的臨床和影像學表現，單憑臨床和影像學檢查不能做出明確的定性診斷。據報道，即使在手術前經多項檢查考慮為惡性狹窄的患者，術后仍有15%～24%的患者被證實為良性狹窄［5，6］。盡管 ERCP膽管刷檢、膽汁細胞學檢查、超聲內鏡引導下細針穿刺活檢術(EUS-FNA)等方法對鑒別診斷有很大幫助，但由于膽管腫瘤常被增生的結締組織包埋，組織獲取困難，脫落腫瘤細胞易在膽汁中變性溶解，檢查陽性率仍較低。文獻報道，膽管刷取物和膽汁細胞學檢查診斷膽管癌的陽性率僅為40%和30%［7］。此外，ERCP膽管刷檢診斷膽管癌的敏感性較低，僅30%～50%;EUS-FNA診斷膽管癌的敏感性達85%，但為有創檢查，不能廣泛開展。血清腫瘤標志物如糖類抗原199、癌胚抗原等對膽管癌的診斷有一定輔助價值，但敏感性和特異性均不高［8］。膽管癌細胞生活在膽汁環境中，加上膽汁酸鹽對癌細胞膜的破壞作用，故膽汁中存在豐富的腫瘤DNA［9］，可作為診斷膽管癌的標本。

研究證實，癌基因K-ras和抑癌基因p53突變與消化道腫瘤的發生密切相關。國外文獻報道，膽管癌p53和K-ras基因突變率為36%～70%，提示p53與K-ras基因檢測對膽管癌的分子診斷有重要意義［10］。但 Itoi等［11］報道，膽管癌患者膽汁標本中p53基因突變率僅33.3%，K-ras突變率可達50%;Yamaguchi等［12］報道，檢測膽汁中 p53 和 K-ras基因突變對胰腺及肝膽管惡性腫瘤的診斷敏感性約為25%，低于脫落細胞學檢查。Ha等［13］報道，胰腺癌胰液上清液K-ras基因突變陽性率高于胰液沉淀物，提示體液上清液的診斷價值高于沉淀物。Wang等［14］分析30例膽管癌患者膽汁上清液和沉淀物中K-ras基因突變，發現上清液中基因突變率高于沉淀物;聯合檢測上清液和沉淀物中K-ras基因突變率，可以顯著提高膽管癌的基因診斷率。本研究不僅從膽汁的沉淀物，而且從膽汁的上清液中提取DNA，進行K-ras、p53基因突變檢測。結果發現，膽管癌患者膽汁標本中存在K-ras、p53基因突變，其中p53基因突變率為70.18%，K-ras基因突變率為77.19%;聯合檢測膽汁上清液和沉淀物標本中K-ras和p53基因總的突變率可高達為85.97%，診斷敏感性提高;并經DNA測序證實。

Kubicka等［15］檢測56例硬化性膽管炎患者膽汁中K-ras基因突變，并進行34個月的隨訪，發現17例膽汁K-ras基因突變陽性患者中有4例發生癌變，而39例K-ras基因突變陰性者均無癌變發生。提示膽汁及膽管刷取物中K-ras基因突變檢測且對膽管癌的早期診斷有一定實用價值。本研究中良性狹窄組均未發現膽汁中K-ras、p53基因突變，對患者進行2年隨訪也均未發現惡性病變;提示膽汁K-ras、p53基因突變檢測對診斷肝外膽管癌特異性較高。

綜上所述，肝外膽管癌患者膽汁上清液及沉淀物中可檢測到K-ras、p53基因突變，且聯合檢測陽性率更高;檢測膽汁中K-ras、p53基因突變情況可用于肝外膽管癌與膽管良性狹窄的鑒別診斷。

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