高壓氧對孤獨癥大鼠行為及外周血IL-1β、IL-6和IL-10水平的影響*

劉仕成，賈飛勇，徐乃軍，夏天亮，張麗萍，姜慧軼#

1)吉林大學第一醫院兒科 長春130021 2)吉林大學第一醫院小兒康復科 長春130021 3)吉林大學第一醫院二部兒科 長春130031 4)吉林大學第一醫院二部急診科 長春130031 5)吉林大學第一醫院神經內科 長春130021

孤獨癥譜系障礙(簡稱孤獨癥)是影響兒童成長發育的重要疾病之一，目前已經引起全世界各個國家的重視。2012年美國疾病預防控制中心數據［1］顯示，孤獨癥自首次報道以來其發病率呈現日益增長的趨勢，患病率約為1．4%。然而孤獨癥目前尚無特效療法。有研究［2］發現，采用高壓氧治療孤獨癥能夠改善患兒煩躁、多動、刻板等行為，提高患兒的語言能力，但是其作用機制尚不清楚。高壓氧作為一種無創性的治療手段，目前已被應用于多個領域，它不但有助于增加機體血氧含量、降低血黏度、改善腦循環、減輕腦水腫及腦細胞的損害，還能夠在某種程度上抑制細胞因子的釋放。有研究［3-4］報道，胎兒期細胞因子水平的失調可能是孤獨癥發生的原因之一。該研究擬建立孤獨癥大鼠模型，比較孤獨癥模型鼠和正常對照鼠的行為及外周血中細胞因子IL-1β、IL-6 和IL-10 水平的差異，并探討高壓氧治療孤獨癥的可能機制，為高壓氧治療孤獨癥提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 實驗動物、主要試劑和儀器 健康成年Wistar雄性大鼠50只，體重(300 ±50)g，雌性大鼠50只，體重(250 ±50)g，購自吉林大學實驗動物部，動物合格證號:SCK(吉2008-0005)。所有實驗動物的喂養及實驗程序均嚴格遵照吉林大學實驗動物保護條款。丙戊酸鈉(VPA)為美國Sigma 公司產品，IL-1β、IL-6 和IL-10 測定試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。曠場實驗及EthoVision 影像跟蹤系統由荷蘭Noldus 公司提供，有機玻璃箱為長春有機玻璃廠制作，程控避暗箱為中國醫學科學院藥物研究所提供，刻板行為檢查裝置為自制，動物實驗用高壓氧艙由吉林大學第一醫院高壓氧科提供。

1．2 VPA 孤獨癥大鼠模型的制備與實驗分組 參照Schneider 等［5］的方法建立和評價孤獨癥動物模型。將育齡雌性與雄性Wistar 大鼠合籠交配繁殖，次日晨檢查到陰栓的雌鼠記為受孕第1天。第12．5天，一部分孕鼠腹腔注射600 mg/kg 的VPA，余孕鼠注射等體積生理鹽水。子鼠出生后母乳喂養至生后21 d 斷乳，區分性別，選用雄性子鼠用于實驗。在20只給予VPA 雌鼠所產子鼠中選擇10只進行高壓氧治療(高壓氧組):大鼠在高壓氧倉中分別吸純氧60 min，壓力為300 kPa，1次/d，連續治療15 d，余10只為模型組。另取腹腔注射等量生理鹽水的孕鼠所產的子代雄鼠10只為正常對照。

1．3 生長發育和行為學評價 對所有實驗子鼠觀察以下指標。

生長發育監測:于生后第7、12、21、35、70天稱量子鼠體重。

運動活性監測:①于出生后第67天用曠場實驗［6］的方法檢測大鼠的自發運動，記錄每只鼠的水平運動次數、垂直運動次數、中央格穿過率及中央格時間百分比、糞便粒數。②于生后第69天，根據文獻［7］的標準，檢測重復刻板行為。

社會行為監測:①出生第35天大鼠社會行為的檢測。實驗前所有大鼠經3．5 h 隔離。實驗開始時，將同一組內的2只大鼠放入測試籠內15 min 進行成對測試。記錄大鼠鉗住另一只大鼠的潛伏期和鉗住次數。②出生第75天大鼠社會行為的檢測。于實驗前1 周將被檢測鼠單籠隔離飼養。實驗當日，每只被檢測鼠和一只刺激鼠共同置于檢測籠內10 min，測定社會行為出現的潛伏期和次數(成年鼠的社會行為包括舔或嗅刺激鼠的身體，追逐刺激鼠或趴或爬到刺激鼠身上)。

學習記憶測試:于大鼠出生第80天，將檢測鼠背對著程控避暗箱洞口放入明箱之中，并啟動秒表，記錄大鼠從明箱進入暗箱的潛伏期，訓練5 min，記錄這期間進入暗箱的次數，24 h 后重復上述操作，記錄進入暗箱的時間及被電次數，此次結果記入實驗結果中。

1．4 血漿IL-1β、IL-6 和IL-10 水平的測定 行為學評分結束后，各組取5只大鼠用鑷子摘下眼球，采集靜脈血約5 mL，4℃、2 000 r/min 離心20 min，留取血漿，采用ELISA 法測定血漿IL-1β、IL-6 和IL-10水平，具體實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1．5 統計學處理 使用SPSS 19．0 處理數據。采用重復測量數據的方差分析比較3組大鼠出生不同時間體重、社會行為出現次數及潛伏期的差異;采用單因素方差分析比較3組大鼠部分自發運動指標的差異，兩兩比較采用SNK-q 檢驗;采用秩和檢驗比較3組大鼠糞便粒數、刻板行為評分及大鼠血漿IL-1β、IL-6 和IL-10 水平的差異。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 3組大鼠生長發育及行為學評價結果

2．1．1 生長發育監測結果 見表1。與正常對照組比較，模型組大鼠發育遲緩，表現為體重偏低，經高壓氧治療后，小鼠體重升高。

表1 出生不同時間3組大鼠體重比較 g

2．1．2 運動活性監測結果 見表2～5。模型組大鼠較正常對照組表現出重復刻板行為及社會接觸的減少，而經高壓氧治療后上述行為有所改善。

表2 3組大鼠自發運動監測指標比較

表3 出生第35天和第75天3組大鼠社會行為出現次數及潛伏期比較

表4 3組大鼠刻板行為比較

表5 3組大鼠被電次數和避暗潛伏期比較

2．2 3組大鼠血漿細胞因子水平 模型組血漿IL-1β、IL-6 和IL-10 水平最高，高壓氧組次之，正常對照組最低。見表6。

表6 3組大鼠血漿IL-1β、IL-6 和IL-10 水平比較ng/L

3 討論

大鼠的胚胎11 d 左右神經管開始閉合，12 d 左右腦運動神經元和核團開始形成［8］。如果胚胎在此期間受到外界不利因素的影響，如VPA 等就會影響神經系統的正常發育而導致神經系統疾病的發生。VPA 孤獨癥動物模型是孤獨癥的經典模型。在受孕12．5 d 的母鼠腹腔注射VPA，其后代子鼠的異常行為表現與孤獨癥患兒相似，比如:社交及探索行為減少、重復刻板行為、焦慮緊張狀態等［5-7］。該實驗中作者建立了VPA 孤獨癥大鼠模型，并進行生長和發育、行為學等相關監測，結果顯示孤獨癥模型大鼠生長發育遲緩、重復刻板行為、社會行為減少，接近人類孤獨癥的行為表現，表明造模成功。

環境因素在孤獨癥的成因中具有重要作用，多種多樣的環境因素可能通過宿主炎癥反應作用于胚胎神經發育決定性的窗口期。細胞因子是由免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激而合成、分泌的一類具有生物學效應的小分子物質。細胞因子及其受體在正常神經的分化和可塑性以及行為編程中具有重要作用，但異常的細胞因子水平則可引起機體認知受損、學習能力差、異常焦慮、刻板行為、社會交往減少等孤獨癥樣行為。在發育過程中，細胞因子和趨化因子在大腦中處于極低的水平，升高的細胞因子被證實可對腦組織的正常發育產生不利影響［9-11］，如:IL-6 水平升高被證實可增加興奮性突觸，減少抑制性突觸，增加樹突的長度和促進蘑菇狀樹突的形成，并可減少海馬處興奮后抑制，進而影響神經環路的平衡和突觸的可塑性;IL-1β 在少突膠質細胞的毒性、神經軸突生長和在海馬穩態突觸可塑性的調節上具有重要作用;IL-10 可抑制促炎因子的合成并抑制炎性細胞的活化、聚集，使活化T 細胞凋亡，抑制淋巴細胞和巨噬細胞功能，對抗腦組織內的過度炎癥性反應，減輕炎癥反應對腦組織的損傷，保護腦組織。該研究結果顯示模型組大鼠血漿中上述3 因子的水平升高，與上述研究結果相符。于方等［8］對缺血缺氧性腦病患兒的研究發現高壓氧治療組患兒血漿及腦脊液中IL-6、TNF-α 與常規治療組相比明顯降低。王國忠等［12］對減壓病小鼠行高壓氧治療后發現腦組織IL-1β 含量降低，而IL-10 含量無明顯改變。包長順等［13］研究證實高壓氧治療后不僅降低了促炎性細胞因子，也降低了抗炎性細胞因子如IL-10。該研究結果顯示，高壓氧治療后，孤獨癥模型鼠生長發育遲緩、重復刻板行為及社會活動減少均有改善，同時血漿IL-1β、IL-6 和IL-10 水平降低，基本與上述研究一致。

綜上所述，孤獨癥的發病可能與細胞因子的表達水平異常有關，高壓氧干預治療可降低IL-1β、IL-6、IL-10 水平，從而改善孤獨癥大鼠的生長發育及社會行為。

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［12］王國忠，高春錦，葛環．高壓氧對減壓病小鼠腦組織IL-1β 和IL-10 含量的影響［J］．航天醫學與醫學工程，2010，23(4):253

［13］包長順，夏佐中，王強，等．高壓氧治療對大鼠重度腦創傷后炎性反應的影響［J］．中華物理醫學與康復雜志，2005，27(5):266