早產大鼠宮內感染肺損傷時支氣管肺泡灌洗液及肺組織中脂肪型脂肪酸結合蛋白的表達*

王 偉，蔡麗霞，崔志瑞，羅向陽

鄭州大學第三附屬醫院兒科鄭州450052

△女，1973年10月生，博士，副教授，研究方向:新生兒及兒童遺傳代謝內分泌，E-mail:weiwang169@126．com

新型支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是常見于早產兒的一種呼吸系統疾病，近年來其發病率呈逐漸上升的趨勢。宮內感染引起肺微血管發育障礙，肺泡合成受阻可能是其發生發展的重要原因［1-2］，但其發病機制目前不清。血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知最有效的調控肺微血管生成和發育的血管生成素蛋白［3］。課題組前期研究［4-5］發現宮內炎性暴露可引起肺組織VEGF 及其受體表達減少，肺組織細胞增殖受抑制，發生類似BPD 的病理改變。新近研究［6］發現脂肪型脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding protein 4，FABP4)是調節肺巨噬細胞活性的重要因子，同時又為VEGF 基因下游因子，其表達受VEGF 調控。該實驗對孕15 d SD 大鼠進行脂多糖(LPS)羊膜腔內注射，觀察宮內感染肺損傷時支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織中FABP4 的表達，探討炎癥對肺微血管發育及重塑的影響及與BPD 發生發展的關系。

1 材料與方法

1．1 主要材料 健康SD 大鼠由河南省實驗動物中心提供。LPS 購于美國Sigma 公司。FABP4 ELISA 檢測試劑盒購自美國R＆D 公司，總RNA 提取試劑(商品名Trizol)購于美國Gibco 公司。小鼠抗FABP4 單克隆抗體購于美國Santa Cruz 公司。隨機引物、M-MLV 逆轉錄酶、RNA 酶抑制劑及Taq DNA 聚合酶購于美國Promega 公司。FABP4 引物(表1)由上海英駿公司合成。

表1 PCR 引物序列及擴增產物大小

1．2 動物模型的制備及分組 參照課題組前期實驗方法［4-5］。選擇定期受孕的SD 大鼠，采用隨機數字表法分成2組:LPS組和對照組，于孕15 d 打開孕鼠腹腔，用微量加樣器將LPS(40 g/L)注射于羊膜腔內，每個孕囊5 μL。對照組注入等體積生理鹽水。早產鼠于孕21 d(預產期為22 d)剖宮娩出，由當日分娩的母鼠作其代母鼠。2組大鼠均于不同時間點即:出生后第1天(P1)、第4天(P4)及第7天(P7)各取8只，以質量分數為20%烏拉坦0．5 mL腹腔麻醉，氣管插管保持肺充氣狀態，開胸放血，右支氣管結扎，迅速切取右肺，用4℃無菌生理鹽水對左肺行肺泡灌洗(2．5 mL×3次)，回收率＞85%，將BALF 在4℃條件下以4 000 r/min 離心10 min，取上清，保存在－80℃冰箱中待測。

1．3 BALF 中FABP4 含量測定 采用ELISA 法檢測BALF 中FABP4 含量，嚴格按說明書進行操作。

1．4 免疫組化法檢測肺組織中FABP4 蛋白的表達采用SP 法。石蠟切片常規脫蠟至水，抗原修復，體積分數為3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過夜，0．01 mol/L PBS充分洗滌后加入生物素標記的羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(37℃30 min)，DAB 顯色，復染封片，鏡下觀察。結果判定以細胞質內有棕黃色顆粒沉著為陽性細胞。陰性對照為0．01 mol/L PBS 代替一抗。FABP4抗體稀釋度均為1 ∶100。每張切片于光鏡下(×200)選取5個視野，固定窗口面積，利用HMIAS-2000 高清晰度彩色醫學圖文分析系統測定吸光度(A)值，以表示FABP4 蛋白的相對表達量。

1．5 RT-PCR 檢測肺組織中FABP4 mRNA 的表達 采用Trizol 試劑提取總RNA，逆轉錄為cDNA，以此為模板行PCR 擴增。PCR 反應條件:94．0℃預變性5 min;94．0℃變性45 s，72．0℃延伸1 min，53．6℃退火45 s，反應32個循環;最后72．0℃延伸7 min。然后用15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳30 min。采用MUVB220 凝膠分析系統(美國Ultralum 公司)對擴增產物進行分析，分別測定各條帶A 值，以目的基因條帶與內參β-actin 條帶A 值的比值作為FABP4 mRNA 的相對表達量。

1．6 統計學處理 采用SPSS 17．0 進行數據分析，2組BALF 中FABP4 含量、肺組織中FABP4 蛋白及mRNA 相對表達量的比較采用2 ×3 析因設計的方差分析，檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 2組早產大鼠BALF 中FABP4 含量的變化結果見表2。

表2 2組早產大鼠BALF中FABP4 含量的變化(n=8) ng/L

2．2 2組早產大鼠肺組織中FABP4 蛋白的表達FABP4 主要表達在肺巨噬細胞、支氣管上皮細胞和血管內皮細胞。結果見圖1、表3。

圖1 不同時間點2組早產大鼠肺組織中FABP4 蛋白的表達(SP，×400)

表3 2組早產大鼠肺組織中FABP4 蛋白的相對表達量(n=8)

2．3 2組早產大鼠肺組織中FABP4 mRNA 的表達結果見圖2、表4。

圖2 2組早產大鼠肺組織中FABP4 mRNA 的表達

表4 2組早產大鼠肺組織中FABP4 mRNA 的相對表達量(n=8)

3 討論

新近研究［6-10］認為宮內感染是引起新型BPD發生的重要因素。FABP4 是調控肺部炎癥反應的重要因子，又是肺微血管生成重要調控因子VEGF及其受體2 的下游因子，其與VEGF 互為調控。FABP4 基因敲除小鼠受到炎癥刺激時巨噬細胞不能分泌IL-1β、TNF-α 等促炎因子;受外源性VEGF干預后，支氣管微血管內皮細胞增殖受阻，支氣管毛細血管網生成密度降低，支氣管發育障礙［11-12］。

該研究發現宮內感染肺損傷早期肺組織中FABP4 表達增加，隨著肺損傷修復及發育，FABP4表達減少，逐漸恢復到正常對照水平。課題組前期研究［4-5］發現宮內感染肺損傷時VEGF 及其受體2的表達時相與該研究中FABP4 的表達時相正好相反。其可能機制為:①由于肺微血管的發育包括支氣管微血管的發育和肺泡微血管的發育。VEGF 主要由肺泡上皮細胞合成，通過旁分泌途徑作用于肺泡微血管。而FABP4 則主要由肺泡巨噬細胞及支氣管血管內皮細胞合成，作用于支氣管微血管。因此，宮內感染肺損傷時，二者反應可不同［6，13］。②宮內感染肺損傷早期由于肺巨噬細胞大量流入、聚集，導致FABP4 表達增加。大量分泌的FABP4 促進支氣管微血管大量生成的同時，又抑制VEGF 及其受體2 表達，使肺泡微血管生成受阻［11］。③隨著肺損傷的修復，肺巨噬細胞聚集減少，FABP4 表達減少，通過調控使VEGF 及其受體2 表達增加，肺泡微血管大量生成，但新合成的肺泡毛細血管呈不連續性，通透性差，為病理性重塑［14］。

該研究還發現宮內感染肺損傷時，隨著肺發育，BALF 中FABP4 含量逐漸增加，與肺組織中的FABP4 表達時相并不完全一致。這可能是因為宮內感染肺損傷早期，炎性因子損傷肺泡和毛細血管基底膜，使肺血管通透性增加，FABP4 外滲，而以后雖然肺組織開始修復，但由于肺微血管為病理性重塑，FABP4 仍然能通過毛細血管基底膜外滲，引起BALF 中FABP4 表達持續增加［15］。

綜上所述，宮內感染肺損傷早期，FABP4 表達增加，而隨著肺損傷修復，FABP4 表達逐漸減少。FABP4 與肺組織VEGF 及其受體表達時相正好相反，從而導致肺微血管合成障礙，發生病理性重塑，肺泡化過程受阻，進而導致新型BPD 的發生。

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