親和體分子在影像、治療和生物技術中的應用

王樂丹 張麗芳

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親和體分子在影像、治療和生物技術中的應用

王樂丹 張麗芳

親和體(affibody)分子由58個氨基酸組成，蛋白相對分子質量約為6.5kDa，其來自于金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)B結構域。含有3個α螺旋結構，其中該親和體分子的第1及第2螺旋中含有13個特定位點的氨基酸，并且這些氨基酸可隨機突變，對其結構無明顯影響，形成可以與任何分子結合的親和體文庫。親和體的功能和抗體類似，但也有一些性質是抗體所沒有的：如相對分子質量小、高親和力、折疊速率快、理化性能穩定、能經受受化學修飾等特點，因此有人稱其為“人工抗體”，在治療、診斷和生物技術中得到廣泛應用。

親和體 治療 診斷 生物技術

親和體(affibody)是一種衍生于葡萄球菌A 蛋白Z 結構域的人工蛋白質分子。為單鏈結構，由58 個氨基酸組成，相對分子質量約為6.5kDa，形成3 個α 螺旋結構，其中第1及第2螺旋中的13 個特定位點的氨基酸對其結構無明顯影響，分別是Q9(谷氨酰胺)、Q10(谷氨酰胺)、N11(天冬酰胺)、F13(苯丙氨酸)、Y14(酪氨酸)、L17(亮氨酸)、H18(組氨酸)、E24(谷氨酸)、E25(谷氨酸)、R27(精氨酸)、N28(天冬酰胺)、Q32(谷氨酰胺)、K35(賴氨酸)，用簡并密碼子NNK(K=G 或者T，包含32 種密碼子，囊括了20 種氨基酸)替換這13 個氨基酸的密碼子，形成很多轉化體，理論上包含3213個基因序列和2013個氨基酸序列，這些轉化體也就組成了affibody文庫，用該文庫對靶標進行篩選，可獲得能與靶標特異結合的親和體[1]。

篩選獲得的親和體與靶分子的結合與抗體和抗原的結合特性相似，但與抗體相比，又具有一些獨特的優勢，如：獲得方法簡便，通過體外篩選即可獲得；容易制備，以化學合成方法或原核表達即可大量制備；同時因為其分子質量小，在生物體內組織穿透性強，并且通過血液后，血漿清除率高，而且親和體分子理化性質穩定，可以通過將其交聯或融合表達與標記分子(如熒光蛋白、生物素等)結合而不影響其與靶分子的結合能力，基于以上這些特性，親和體有望作為抗體的替代品，用于蛋白質識別、分離及純化、實驗診斷、分子顯像及靶向治療等[2]。在本文中，我們將回顧親和體分子作為一種可行的，有時甚至比抗體更好的替代品，在治療、體內成像和生物技術中的應用。

一、親和體的展示方法

親和體的展示方法包括噬菌體展示技術、核糖體展示技術、細胞展示技術及蛋白質互補分析技術等，其中以噬菌體展示技術最為常見。

噬菌體展示技術是以改造的噬菌體為載體，在噬菌體外殼蛋白基因區定向插入待選的基因片段，使噬菌體表面能展示這些外源多肽或表達的蛋白質，通過多次淘洗的方法，進一步富集表達有這些多肽或蛋白質的噬菌體，從而得到具有特異性結合的多肽或蛋白質的一種生物學技術[3]。噬菌體展示技術最大的特點，是基因型能直接反映表達型，而且在噬菌體表面展示的外源多肽或蛋白質不影響噬菌體的天然構型及生活周期。目前這項技術已經成功篩選了Aβ、EGFR、 HER-2等多種靶蛋白親和體。

核糖體展示技術(ribosome display technology, RDT)是一種利用功能性蛋白間相互作用而進行篩選的新技術，它是在多聚核糖體展示技術的基礎上發展而來。最早由Plückthun 實驗室首先提出，他們將折疊正確的蛋白及其相應 mRNA同時結合在核糖體上， 形成蛋白質-核糖體-mRNA的三聚體，使目的蛋白的表型和基因型聯系起來，常用于抗體及蛋白質文庫的選擇、蛋白質體外改造等[4]。

親和體文庫也可以直接展示在細胞表面，細胞展示和噬菌體展示類似，但細胞比噬菌體大，可使用定量流式細胞術進行文庫排序和篩選后的鑒定[5]。有研究人員將親和體文庫在革蘭陽性細菌肉葡萄球菌中表達并且展示在細胞表面，進行TNF-α親和體的篩選。新近發展起來的另一個篩選方法是蛋白質互補分析(PCA)，它通常用于研究天然蛋白質間相互作用。相比其他展示系統，這種方法的靶標是在細胞內，從而避免了靶蛋白的生產和純化過程[6]。另外，由于 PCA是通過介質中存活克隆來篩選陽性克隆，故可以通過簡單的培養完成特異親和體的篩選。

二、親和體的應用

1.在影像學中的應用:在目前常規臨床實踐中，重要的診斷手段有解剖成像，例如計算機斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)，也有分子水平上功能性或分子成像，如單光子發射光譜儀(SPECT)或正電子發射斷層掃描(PET)。分子成像研究中的絕大部分是使用葡萄糖類似物進行的2 - [18F]氟-2 - 脫氧-D-葡萄糖(18F-FDG PET)，其對檢測轉移性和復發性疾病及其有用[7]。然而，18F-FDG PET的結果是非特異性的，不能鑒別癌細胞表面特異性受體，如人表皮生長因子受體2(HER-2)，因此不能用于靶向治療。理想的成像劑應具有特異性和親和性。此外，快速的生物分布和組織滲透，使局部濃度富集，以及未結合示蹤劑快速清除，從而形成高對比度的腫瘤成像[8]。最近的研究表明，親和體分子具有最佳示蹤劑的特性，在HER-2特異性分子成像中，親和體分子可以在給藥后的第1個小時內找到并結合到靶標，而且未結合部分血液清除率快。

親和體分子的第1例特異性放射性標記是Orlova[9]報道的。在這項研究中，親和體分子ZHER-2：342是通過合成制備的肽，將具有DOTA的一個化學過程耦合到N末端，得到DOTA-ZHER-2：342-PEP2(ABY-002)。 ABY-002是有效的，穩定的溫度為60～90℃。111In - ABY-002在SKOV-3荷瘤小鼠體內的分布顯示，注射后1h有效的腫瘤吸收了23%ID/g，腫瘤血液比值(T/B)的1h后為12，4h達到120。在所有時間點，除腎臟外，腫瘤攝取比所有其他器官的攝取高?？焖俳档脱褐械姆派湫苑e累，在尿液中顯示快速清除，其主要由腎小球濾過。111In - ABY-002的快速動力學允許HER-2過度表達的腫瘤在注射后1h可視化。 雙標記實驗，即在小鼠異種移植模型中共注射68Ga-和親和體分子與兩個不同的放射性金屬標記，一是伽馬發射器和一個正電子發射體。結果顯示相似的腫瘤同時攝取兩種分子。然而，68Ga-ABY-002在血液、肺、脾的放射強度比111In- ABY-002 顯著低。因此，圖像的對比度是68Ga-ABY-002 PET圖像比111In - ABY-002略勝一籌。近日，HER-2靶向親和體被連接到超順磁性氧化鐵顆粒對腫瘤進行靶向造影，結果在腫瘤部位可見帶有親和體親和性的超順磁性氧化鐵顆粒信號。實驗證明，親和體分子可以帶有大量的各種放射性核素，因此親和體用做SPECT或PET示蹤劑是可能的[10]。

2.在靶向治療的應用:親和體分子在影像學中的應用，其實是通過將放射性核素作為它的有效負載來實現的，如果選用治療腫瘤的藥物替代放射性核素來充當親和體分子的負載，那么通過連接親和體分子和抗腫瘤藥物，或者載有抗腫瘤藥物的給藥系統，就可實現腫瘤的靶向治療。目前親和體分子在藥物載體方面的應用大多是將親和體分子連接到納米粒表面，納米粒是由高分子材料制備的具有“核-殼結構”的材料，通過親和體的特異性和親和性，使納米粒達到靶向的功能[11]。Alexis 等[12]將親和體分子Cys-ZHER-2:342偶聯到納米粒表面，制備了靶向納米粒，同時設置非靶向納米粒為對照，用SKBR-3 和SKOV-3 兩個細胞系來評估它們的外攝取和細胞毒性，結果顯示兩種細胞系中靶向納米粒組的細胞攝取率和殺傷活性均優于非靶向納米粒組，說明其制備的靶向納米粒具有應用前景。

也有研究者通過基因重組技術將毒素的編碼基因與親和體分子進行克隆融合重組，經在體外細菌中表達、純化, 制備出免疫毒素，以親和體作為導向分子, 將毒素靶向癌細胞, 達到治療的目的。最新研究表明，Zielinski等[13]在HER-2的高特異性高親和體分子上融合免疫毒性蛋白PE38，制備了HER-2的高親和的毒性分子親和體，按照0.25mg/kg的劑量尾靜脈注射于接種了HER-2高表達的卵巢癌細胞SK-OV-3的腫瘤模型裸鼠，連續注射6次，30天后腫瘤消失。于脂質體雙層插入HER-2特異性的親和體分子也可靶向殺傷HER-2高表達的腫瘤細胞，從而提高治療效果和安全效果。這些為腫瘤的治療提供了更為有效的新的治療手段。

3.在生物技術中的應用：由于親和體分子具有和抗體相似的親和性，而且結構穩定，分子質量小，故已被廣泛地用于抗體的生物分離，如親和層析、免疫沉淀等生物技術。目前， 親和體 AB公司與GE Healthcare公司一起研制親和體的改進方式，如堿穩定版本，為耐受性提高到堿處理再生在親和層析中。近來有研究表明，親和體分子在酶聯免疫吸附測定和免疫組化的應用中也取得了相應的進展。Friedman 等[14]還用親和體分子作為熒光探針檢測細胞表面EGFR 和HER-2 受體的表達水平。有關ELISA設置中，親和體分子作為親和探針固定在蛋白質微陣列。例如，在一項研究中將二聚體的親和體分子與IgA抗體，IgE抗體，IgG抗體，腫瘤壞死因子，胰島素和Taq聚合酶親和體，分別固定在硫醇葡聚糖微陣列載玻片，隨后孵化與熒光標記的分析物，露出各自靶蛋白的特異性結合，而且沒有觀察到交叉反應。

總之，親和體分子代表了一類新的親和性配體，由于其具有分子質量小、結合力高、特異性強、靶向濃聚迅速、血液清除快等優點，在過去的20年中，在成像、靶向治療和生物技術等方面得到了廣泛研究。目前已經成功地用親和體分子診斷HER-2表達陽性的癌癥患者，而且也有將親和體分子作為IgG親和純化柱的親和配體，商業化后年銷售額達數千萬元。目前親和體分子的應用領域日益廣泛，隨著更多親和體的開發，親和體有望替代抗體，完成目標蛋白檢測、分離、腫瘤影像診斷及治療等作用。

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(修回日期：2015-02-26)

國家自然科學基金資助項目(81172463)；溫州市科技局基金資助項目(Y20140319)

325000 溫州醫科大學附屬第二醫院(王樂丹)； 325000 溫州醫科大學(張麗芳)

張麗芳，教授,博士生導師，電子信箱：zlf@wzmc.net

R392

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.005

2015-01-14)