羊膜的結構功能特性和臨床應用

于洪蛟 徐 林 張立陽 李永華 梁洪生 張相彤

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羊膜的結構功能特性和臨床應用

于洪蛟 徐 林 張立陽 李永華 梁洪生 張相彤

經過多年的研究，可以了解羊膜的組織結構和功能特性，特別是羊膜來源細胞的多向分化潛能。羊膜含有多種生物活性物質，具有抗炎、抗菌、抗病毒、低免疫原性、非致瘤性等特性。羊膜移植生物相容性好，能促進上皮再生、減輕不良反應，并且無倫理爭議等。羊膜臨床應用廣泛，特別是在治療眼表疾病、皮膚損傷、膜性組織損傷等方面。隨著研究深入，羊膜在抗腫瘤上也嶄露頭角，如羊膜來源細胞能抑制癌細胞增殖和促進其凋亡等，值得進一步研究。

羊膜 特性 臨床應用 抗腫瘤

羊膜是胎盤的最內層光滑、無血管、神經及淋巴的半透明薄膜，作為一種良好的生物材料，羊膜因其獨特的結構功能屬性已被廣泛應用于基礎研究和臨床。早在20世紀初，就有文獻報道將羊膜應用于皮膚移植，治療皮膚燒傷和潰瘍。隨著研究的深入，羊膜移植在眼表重建、皮膚損傷修復中取得了突破性進展。近年來，羊膜被認為是一種治療與眼、口腔、皮膚、泌尿生殖道等相關疾病的新策略，在抗腫瘤方面也逐漸被人們所關注[1，2]。本文重在介紹羊膜的結構功能特性及常見的臨床應用。

一、羊膜的結構和功能

羊膜厚度約0.02～0.5mm，由內向外由單層上皮層、薄的基膜層、厚的間質層3層構成[1,3]。上皮細胞呈立方形，核大而不規則，胞質豐富，具有豐富的胞飲小泡和細胞器，表面有很多具有活躍的分泌和轉運功能的微絨毛。上皮細胞表達多種細胞標志物，如糖蛋白CA125、縮宮素受體，CD44和肌間絲蛋白抗原也呈陽性。人羊膜上皮細胞還表達促紅細胞生成素及其受體，在羊膜中的功能依然未知?；ぶ泻写罅康牧蛩嵋阴８嗡氐鞍拙厶?，對羊膜高分子物質起到滲透屏障作用，并與膜收縮蛋白、彈性蛋白、層粘連蛋白等共同維持著羊膜結構的完整性。間質層又可分為致密層、纖維細胞層和海綿層。致密層含有豐富的膠原纖維，纖維細胞層是主要由纖維母細胞組成的松散的網格狀結構，海綿層含有豐富的蛋白聚糖、糖蛋白和Ⅲ型膠原蛋白,羊膜很容易在海綿層從絨毛膜層上鈍性分離[3]。

羊膜最基本的功能是保護胚胎/胎兒并為其發育提供適宜的懸浮液體環境，緩沖周圍的壓力使胎兒能自由的、活動的生長。羊膜含有的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白和彈性蛋白，使其能抵抗一定的張力，并具有一定的彈力。羊膜能轉運多種可溶性物質，并能合成分泌多種生物因子，如血管活性肽、生長因子、細胞因子等。懷孕期間羊膜上皮細胞代謝活躍，對于維持羊水恒定的pH值有重要作用。在分娩時羊膜也具有重要作用，前列腺素是誘發子宮收縮的主要內源性因子，起著誘發破膜、啟動和維持宮縮等作用，羊膜高表達前列腺素合成酶的關鍵酶，可以合成高濃度的前列腺素[4]。

二、羊膜的特性

1.羊膜細胞的多向分化潛能:羊膜細胞主要是由來源于外胚層的上皮和來源于中胚層的間充質兩類細胞構成，表達與胚胎干細胞相關的標志物，如SSEA-3、SSEA-4、 TRA-1-60和 TRA-1-81等，具有多向分化潛能，可誘導分化成為3個胚層不同類型的細胞，在細胞治療中有很大的應用潛力[2]。(1)肝細胞：羊膜上皮細胞表達白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、角蛋白18等和其他肝細胞相關的基因。此外，在羊膜上皮細胞中也發現參與肝細胞轉錄過程中的調節基因肝細胞轉錄因子亞型3γ(HNF-3γ)和轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白α(C/EBPα)。HNF-3γ主要誘導白蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、轉甲狀腺素蛋白的表達，C/EBPα可調控糖原的儲存、白蛋白、甲胎蛋白、酪氨酸轉氨酶的表達羊膜上皮細胞可誘導分化為肝細胞樣細胞，并表現出蛋白合成和分泌、糖原儲存、尿素的合成、細胞色素P450-3A4(CYP3A4)的表達、低密度脂蛋白的攝取等肝細胞功能，也表達一些參與脂肪、膽固醇、膽汁酸合成有關的基因[2，5]。以上表明，人羊膜上皮細胞和(或)羊膜移植可成為治療肝臟疾病的新途徑。(2)心肌細胞：成人心肌細胞幾乎沒有再生能力，細胞心肌成形術是治療嚴重心臟疾病的新方法。羊膜間充質細胞表達心肌特異性轉錄因子GATA4，心肌特異性基因，如肌球蛋白輕鏈(MLC)-2a、MLC-2V、cTNI、cTNT、心臟特異性L-型鈣離子通道和外向瞬時鉀離子通道的α亞基。通過堿性成纖維細胞生長因子或激活素A等特定因子的刺激，羊膜間充質細胞能表達心肌特異性轉錄因子(Nkx2.5)和心肌特異性標志物(心房利鈉肽)[6]。GATA4和Nkx2.5調節心肌特異性基因的表達，是心肌前體細胞最早期的標志，它們的激活意味著心肌細胞分化程序的啟動。共培養實驗證實，間充質細胞能夠融入心臟組織并有與心臟組織同步的自發收縮能力，表達心臟特異性標志物[6]。(3)軟骨細胞：羊膜細胞表達軟骨細胞相關基因，如SOX家族、骨形成蛋白(BMP)及其受體[2，7]。羊膜細胞在體外通過特定物質的誘導后表達軟骨細胞特異性標志物COMP、AGC1、CSPG2、COL1A1、COL9A2、MIA等，并在培養基質中發現糖胺聚糖(GAG)的積累，具有典型的軟骨細胞的形態和功能特性，可成為骨組織工程的種子細胞[8]。羊膜細胞經過PKH26標記后與PLGA載體植入兔膝關節后，細胞能存活且有較好的生物相容性，顯示了羊膜細胞在治療軟骨疾病的潛在價值[7]。(4)胰島β細胞：胰島β細胞移植開辟了治療晚期糖尿病的新的途徑，然而常因供體細胞稀少而受限。研究報道，人羊膜上皮細胞可誘導分化為產生胰島素的功能細胞，表達多個胰島β細胞基因，在移植入鏈脲霉素誘發型糖尿病小鼠后，能合成和分泌胰島素，可使血糖水平正?；痆9]。表明羊膜上皮細胞在體內具有分化成胰島β細胞的潛力，對1型糖尿病有潛在的治療價值。(5)神經細胞:羊膜細胞表達多種神經元和膠質細胞標志物，如波形蛋白、神經纖絲蛋白等，還能以合成和釋放乙酰膽堿、兒茶酚胺、多巴胺、激活素、Noggin及各種神經營養因子[10]。人羊膜細胞表達神經前體細胞的標志物，并能分化成神經元，多巴胺能神經元，星形膠質細胞和少突膠質細胞；移植入帕金森大鼠側腦室后，羊膜細胞能分化成酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞，改善大鼠的帕金森癥狀，并能促進大鼠內源性神經再生[11]。羊膜間充質干細胞能誘導分化成神經干細胞樣細胞，表達更高水平的神經干細胞標志物和神經營養因子，移植入體內能促進大鼠腦損傷的修復[10]。 (6)聽覺系統：體外培養的人羊膜上皮細胞的細胞膜和細胞核上表達間隙連接蛋白Cx26，在細胞膜上和細胞質中還表達鈉鉀泵，此為耳蝸成纖維細胞的特有屬性，成纖維細胞維持著耳蝸的正常組織結構和功能，表明羊膜上皮細胞有作為功能性成纖維細胞使用的可能。移植入豚鼠耳蝸后，羊膜上皮細胞能持續3周表達Cx26和鈉鉀泵，為進一步研究提供了依據[12]。

2.抗炎、抗菌、抗病毒、低免疫原性：羊膜具有抗炎、抗菌、抗病毒性和低免疫原性，是較理想的移植物。其機制尚未完全清楚。一方面，羊膜作為物理屏障，可阻止炎性細胞的浸潤，并能吸引、誘捕炎性細胞，從而降低炎性介質的釋放。羊膜移植后可防止死腔形成、減少分泌物的積聚，基質的膠原纖維還具有止血效果，可防止術后血腫形成從而降低感染風險[1]。另一方面，羊膜表達一些抗菌肽，如防衛素、彈力素及分泌性白細胞蛋白酶抑制劑(SLPI)等，具有抗炎、抗感染作用[13]。羊膜細胞能合成分泌多種抗炎因子，如IL-1和IL-2受體拮抗劑、內皮抑制素等，減輕炎性反應。羊膜上皮細胞的上清液可抑制中性粒細胞和巨噬細胞的趨化活性，減少T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖并誘導其凋亡。此外，羊膜還表達一些基質金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑，能抑制MMPs參與的炎性反應、血管重建等病理反應[1]。羊膜富含的膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，哺乳動物同型膠原的氨基酸種類、排列、數目基本相同，具有良好的生物相容性。羊膜細胞表達免疫抑制因子CD59和HLA-G等，具有一定的免疫抑制功能。羊膜移植后免疫應答微不足道，未出現明顯的排斥反應，似乎是無免疫原性的組織。然而關于羊膜免疫應答的研究報道較少，對于新鮮羊膜和保存羊膜的免疫原性和臨床應用仍然存在爭議，隨著研究應用的深入，羊膜移植的免疫安全性也日益被人們所關注。

3.抗新生血管形成：人羊膜能抑制角膜新生血管的形成，降低角膜表面的血管化，對治療角膜疾病有很重要的作用。一方面可能為羊膜作為物理屏障可抑制血管內皮細胞的增殖和遷移，從而阻斷新生血管的形成。另一方面，羊膜基質中含有大量的諸如層粘連蛋白-1、-5，纖連蛋白,膠原蛋白Ⅶ等，均參與抑制角膜新生血管的行成。此外，羊膜細胞還合成各種生物活性物質，包括抗血管形成因子、內皮抑素和血小板反應蛋白-1(TSP-1)。TSP-1能抑制由VEGF或bFGF誘導的血管形成，內皮抑素是目前已知最強的內源性血管形成抑制因子，抑制內皮細胞增殖、遷移、黏附，促進凋亡、抑制促血管形成因子的生物學作用。羊膜能表達色素上皮衍生因子(PEDF)、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-4、IL-10等都能抑制血管形成的過程[14]。

4.促進上皮生成和抗纖維化：羊膜能作為良好的細胞外基質能增強上皮細胞的黏附、促進增殖遷移、抑制凋亡，促進上皮形成[15]。羊膜中存在表皮生長因子(EGF)、角質細胞生長因子(KGF)、肝細胞生長因子(HGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)等促進傷口愈合的生物活性物質，特別是EGF和KGF，能促進上皮細胞增殖和遷移，在創口愈合中有重要作用。新鮮羊膜含有豐富的高分子質量的透明質酸，不僅有利于細胞遷移，還具有一些抗炎和免疫抑制功能[1]。瘢痕組織的形成主要因成纖維細胞的過度增生，TGF-β能激活成纖維細胞，而羊膜能抑制TGF-β受體在成纖維細胞中的表達從而抑制纖維化。角膜受損可引起角膜成纖維細胞的凋亡，激發角膜基質細胞活化增生，引起一系列的角膜損傷修復反應。羊膜可減輕由IL-1誘導的細胞凋亡，從而減輕角膜成纖維細胞的活化增生，在減輕角膜損傷的修復和抗瘢痕形成中有重要作用。由此可見，羊膜促進創口的愈合是通過調控組織的重建而非促進瘢痕組織的形成。

5.非致瘤性和無倫理爭議：羊膜上皮細胞缺乏端粒酶，無法在體外無限擴增，克服了細胞移植后在宿主體內致癌的可能，具有非致瘤性。至今為止，動物實驗中接受羊膜及羊膜細胞移植后的實驗動物患者未有致瘤性報告。分娩后的胎盤通常是作為廢棄物處理的，羊膜的取材無倫理道德爭議，通過倫理委員會的批準和捐贈者的同意羊膜在臨床上應用可以推廣。為了保證羊膜的質量，捐贈者必須經過血清學檢驗，保證無傳染性和惡性腫瘤疾病，建議選擇自愿的剖宮產婦女。

三、羊膜的臨床應用

1.眼表重建：羊膜移植能重建眼表結構、維持眼表穩定，使受損的角膜或結膜快速上皮化，減少瘢痕形成，減輕炎性反應，減輕瞼球粘連、抑制角膜血管化、提高視力等，在治療各種原因所致的眼表損傷、潰瘍、眼表腫瘤、難治性青光眼等疾病中取得了良好的效果，具有明顯的優勢。近年來，在治療限制性斜視上羊膜也逐漸獲得青睞，羊膜移植后能防止術后瘢痕形成、減輕偏向角、改善了轉向[15，16]。

2.皮膚修復：如何在治療燒傷、創傷、脈管系統疾病等患者的皮膚損傷中使傷口達到最佳愈合效果，一直是人們的研究焦點。羊膜輔料具有天然的生物基質并含有一些生物活性物質，具有抗炎、抗感染、促進上皮再生、減輕疼痛、減少滲出等性能，臨床應用于皮膚的修復均取得了良好效果，與其他輔料相比具有明顯的優勢。特別是在治療慢性不愈創口上，羊膜能抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)相關的炎性反應，抑制組織的破壞，減少了傷口滲出和色素沉著，加速傷口的愈合[17]。

3.術后防粘連：Asherman綜合征是由于刮宮時損傷宮頸管黏膜或子宮內膜基底層、肌層、局部創面形成而致粘連，臨床常見閉經、月經減少或不孕，多次人工流產、術后感染及術后卵巢功能低下易引起。首選治療方法為宮腔鏡，臨床研究報道，在宮腔鏡松解后應用羊膜移植能顯著減少術后粘連復發和增強子宮內膜再生[18]。

4.膜性組織修復：羊膜也被廣泛應用于泌尿生殖道的修復和重建、口腔鼻腔黏膜的修復，有助于組織損傷的修復和功能的恢復。Koziak等[19]首次報道應用羊膜進行男性尿道的重建，對治療男性尿道狹窄提供了新的策略，隨后，羊膜應用于輸尿管狹窄的重建也取得了良好效果。Arai等[20]應用羊膜修復口腔黏膜能很好地與裸露的結締和肌肉組織結合，減少出血，促進口腔黏膜的再生。

四、羊膜與再生醫學

羊膜來源細胞具有多向分化潛能、低免疫原性、非致瘤性等，能分泌和成多種生物活性物質，在細胞工程中具有很大的應用前景。動物實驗證實，羊膜來源細胞移植治療心肌梗死、肝臟疾病、糖尿病、軟骨疾病、帕金森病等疾病均取得了理想效果[ 6～12 ]。羊膜作為天然無毒的高分子材料，組織相容性好，易于細胞黏附，來源廣泛，易于塑型等優點，是較理想的生物載體和支架材料?？蓱糜跇嫿ńM織工程皮膚、血管、角膜、神經等，具有很大的應用前景[3]。

五、羊膜潛在的抗腫瘤價值

近年來，羊膜的抗腫瘤作用逐漸被人們所關注。Niknejad等報道羊膜上皮細胞可誘導癌細胞的凋亡，同時羊膜能減少腫瘤新生血管的形成，阻止了腫瘤營養物質和氧的供應，從而減輕腫瘤生長、轉移的風險。羊膜細胞表達的一些白介素如IL-2、IL-4 和IL-3，能增強自然殺傷細胞(NK)的細胞殺傷活性，增強對腫瘤細胞的攻擊，限制腫瘤的生長。Magatti等報道羊膜間充質細胞能誘導癌細胞周期停滯在G0/G1期，減少癌細胞的增殖。干細胞治療為腫瘤的研究治療提供了新的方向和新的靶點。羊膜來源干細胞具有高速增殖能力，也表達多能干細胞特定標志物OCT4，在體外具有分化為3種胚層細胞的潛能。并且具有無致瘤性、低免疫原性、抗感染、來源廣泛、易于分離取材等優點，為抗腫瘤提供了新的細胞源。羊膜來源干細胞含有某些生物活性物質，能改變細胞生長周期，從而能消弱腫瘤的生長。在Mencucci等的研究中，應用抗病毒藥處理過的羊膜在體外可以抑制病毒的復制，表明羊膜具有吸收抗病毒藥物和維持藥物釋放的能力。這項研究為控制藥物的釋放開辟了新的途徑，藥物溶浸后的羊膜可能在治療其他疾病方面發揮重要作用，在腫瘤治療上也值得進一步研究。

綜上所述，羊膜作為天然的生物材料來源廣泛、易于取材，含有多種生物活性物質，具有抗炎、抗菌、抗病毒、低免疫原性、抑制新生血管形成、促進上皮再生、非致瘤性等特性，羊膜細胞具有多向分化潛能，能分化成肝細胞、心肌細胞、軟骨及成骨細胞、胰島β細胞等。在眼表重建、皮膚損傷修復、組織工程等方面有很大的應用價值，在抗腫瘤方面仍需進一步探究。

1 Litwiniuk M，Grzela T.Amniotic membrane: new concepts for an old dressing[J].Wound Repair Regen,2014,22(4):451-456

2 Diaz-Prado S,Muinos-Lopez E,Hermida-Gomez T，etal. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells for regenerative medicine[J].Differentiation,2011,81(3):162-171

3 Okabe M,Kitagawa K,Yoshida T，etal. Hyperdry human amniotic membrane is useful material for tissue engineering: physical, morphological properties, and safety as the new biological material[J].J Biomed Mater Res A,2014,102(3):862-870

4 Alzamil HA,Pawade J,Fortier MA，etal. Expression of the prostaglandin f synthase akr1b1 and the prostaglandin transporter slco2a1 in human fetal membranes in relation to spontaneous term and preterm labor[J].Front Physiol,2014,30,(5):272

5 Marongiu F,Gramignoli R,Dorko K，etal. Hepatic differentiation of amniotic epithelial cells[J].Hepatology,2011,53(5):1719-1729

6 Otaka S,Nagura S,Koike C，etal. Selective isolation of nanog-positive human amniotic mesenchymal cells and differentiation into cardiomyocytes[J].Cell Reprogram, 2013, 15(1):80-91

7 Nogami M,Tsuno H,Koike C，etal. Isolation and characterization of human amniotic mesenchymal stem cells and their chondrogenic differentiation[J]. Transplantation, 2012, 93(12):1221-1228

8 Lindenmair A,Nurnberger S,Stadler G，etal. Intact human amniotic membrane differentiated towards the chondrogenic lineage[J].Cell Tissue Bank,2014,15(2):213-225

9 Hou Y,Huang Q,Liu T，etal. Human amnion epithelial cells can be induced to differentiate into functional insulin-producing cells[J].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2008, 40(9): 830-839

10 Yan ZJ, Zhang P,Hu YQ，etal. Neural stem-like cells derived from human amnion tissue are effective in treating traumatic brain injury in rat[J].Neurochem Res,2013,38(5):1022-1033

11 Yang X,Song L,Wu N，etal.An experimental study on intracerebroventricular transplantation of human amniotic epithelial cells in a rat model of parkinson′s disease[J].Neurol Res, 2010, 32(10):1054-1059

12 Yuge I, Takumi Y, Koyabu K,etal.Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear[J]. Transplantation 2004, 77(9): 1452-1454

13 Tehrani FA, Ahmadiani A, Niknejad H. The effects of preservation procedures on antibacterial property of amniotic membrane[J].Cryobiology,2013,67(3):293-298

14 hay E,He H,Sakurai S，etal. Inhibition of angiogenesis by hc.ha, a complex of hyaluronan and the heavy chain of inter-alpha-inhibitor, purified from human amniotic membrane[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2011,52(5):2669-2678

15 Celik T, Katircioglu YA, Singar E，etal. Clinical outcomes of amniotic membrane transplantation in patients with corneal and conjunctival disorders[J].Semin Ophthalmol,2013,28(1):41-45

16 Tugcu B, Helvacioglu F, Yuzbasioglu E，etal. Amniotic membrane in the management of strabismus reoperations[J].Jpn J Ophthalmol,2013,57(2):239-244

17 Litwiniuk M, Bikowska B, Niderla-Bielinska J，etal. Potential role of metalloproteinase inhibitors from radiationsterilized amnion dressings in the healing of venous leg ulcers[J].Mol Med Rep, 2012, 6(4): 723-728

18 Johary J, Xue M, Zhu X，etal. Efficacy of estrogen therapy in patients with intrauterine adhesions: systematic review[J].J Minim Invasive Gynecol,2014,21(1):44-54

19 Koziak A, Salagierski M, Marcheluk A，etal. Early experience in reconstruction of long ureteral strictures with allogenic amniotic membrane[J]. Int J Urol,2007,14(7):607-610

20 Arai N, Tsuno H, Okabe M，etal. Clinical application of a hyperdry amniotic membrane on surgical defects of the oral mucosa[J].J Oral Maxillofac Surg,2012,70(9):2221-2228

(修回日期：2015-02-29)

國家自然科學基金資助項目(81041082)；黑龍江省杰出青年科學基金資助項目(2011M501059)

150001 哈爾濱醫科大學附屬第一醫院神經外科

張相彤，教授，電子信箱：zgxgtg@sina.com

R318

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.050

2015-01-20)