蘆丁對大鼠胃缺血再灌注損傷的保護作用

王志東，高 峰

(濰坊醫學院藥理學教研室，山東濰坊 261053)

隨著對胃缺血再灌注損傷病理生理機制研究的不斷深入，近年來一氧化氮(NO)在胃黏膜病變過程中的作用日益受到關注［1－2］。蘆丁屬于黃酮類化合物，以往研究表明［3］，蘆丁對炎癥引起的NO過量生成具有抑制作用。此外，有資料提示［4］蘆丁對冷凍—束縛應激引起的胃黏膜損傷具有保護作用。然而，蘆丁對胃缺血再灌注損傷的保護作用，國內外尚未見文獻報道。本實驗以大鼠胃缺血再灌注損傷模型研究蘆丁對胃黏膜的保護作用，用光鏡觀察再灌注損傷后大鼠胃黏膜組織形態學的變化，并測定胃黏膜組織中髓過氧化物氧化酶 (myeloperoxidase，MPO)活性及胃壁黏液和NO的含量，同時對胃黏膜組織中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、總NOS(TNOS)、誘導型(iNOS)和結構型 NOS(cNOS)活性進行了測定，以探討蘆丁對大鼠胃缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 蘆丁:Sigma公司，實驗前用蒸餾水溶解。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號A001－1)、總丙二醛(MOD)測試盒(批號 A003－1)、一氧化氮(NO)試劑盒(批號 A012)、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(批號A014－1)、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(批號 A044)、蘇木素伊紅 (HE)染色試劑盒(批號D005－1，D019－1)(均為南京建成生物工程研究所)。其他均為AR級化學試劑。

1.2 實驗儀器 高速勻漿機:上海弗魯克流體機械制造有限公司;751G-可見紫外分光光度計:上海分析儀器廠;IX71光學顯微鏡:日本奧林巴斯光學工業株式會社。

1.3 實驗動物和分組 普通級，♂，SD大鼠，體質量220～240 g(濰坊醫學院實驗動物中心提供)。實驗前24 h禁食，自由飲水，室溫 (23±2)℃。將SD大鼠隨機分為5組:假手術組、缺血再灌注組、蘆丁高劑量組、蘆丁中劑量組、蘆丁低劑量組。蘆丁用生理鹽水稀釋，給藥組分別灌胃給予3種不同劑量蘆丁 (50、100、200 mg·kg－1)，連續 5 d，大鼠于末次給藥前24 h禁食，末次給藥后60 min實施胃缺血再灌注。

1.4 胃黏膜損傷模型制備及胃黏膜損傷指數測定采用Zhang等［5］方法，用動脈夾夾閉大鼠腹腔動脈30 min，再灌注1 h以制備大鼠缺血再灌注(GI/R)損傷模型。大鼠麻醉，打開腹腔沿胃大彎處剪開，用冰冷的生理鹽水沖洗，在冰盤上展開，置方格計數板(每一方格面積為1 mm2)，以局限于胃腺上皮的點狀糜爛、潰瘍和出血灶的長度累計積分:正常為0分，損傷≤1 mm計1分，≤2 mm計2分，其余類推;損傷寬度超過1 mm時加倍積分，每組大鼠損傷指數的平均值作為改組胃黏膜損傷指數 (gastric mucosal damage index，GMDI)。

1.5 蘇木素—伊紅染色觀察胃黏膜的損傷 測量完損傷指數的胃，于冰盤上剪開，一半腺胃置于－80℃保存待用;一半腺胃置于4%多聚甲醛中固定后，乙醇脫水后用石蠟包埋，5μm切片，HE染色，于顯微鏡下觀察病理改變。采用雙盲法，在O-lympus光學顯微鏡下觀察胃組織形態學變化。

1.6 生化指標的檢測 取胃黏膜于冷生理鹽水中勻漿，按試劑盒方法進行操作，檢測SOD、cNOS、iNOS、TNOS、MPO活性及MDA含量。

1.7 胃壁黏液測定 按Bolton等［6］的阿利新藍法測定胃壁結合黏液。大鼠缺血再灌注后，取胃，沿胃大彎剪開后將胃黏膜外翻，浸入阿利新藍中室溫放置2 h將胃取出，染液離心后，取上清液在751G－可見紫外分光光度計上于650 nm波長條件下比色，計算染料結合量。

2 結果

2.1 蘆丁對大鼠缺血再灌注胃黏膜損傷的影響肉眼觀察顯示:假手術組動物胃黏膜完好;而缺血再灌注組動物胃黏膜損傷嚴重，可見點狀、條索狀和片狀缺損，即潰瘍形成，潰瘍面有出血現象，胃黏膜損傷指數明顯高于對照組 (P＜0.001);與缺血再灌注組相比，蘆丁低、中、高劑量組動物的胃黏膜損傷均明顯減輕(P ＜0.001或P ＜0.01)，結果見表1。

表1 蘆丁對大鼠缺血再灌注胃黏膜損傷的影響(±s n=8)

表1 蘆丁對大鼠缺血再灌注胃黏膜損傷的影響(±s n=8)

注:＊＊＊P ＜ 0.001，vs假手術組;##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001，vs缺血再灌注組。

組別 給藥劑量/mg·kg－1胃黏膜損傷指數假手術組 —2.2 ± 2.1缺血再灌注組 — 132.1 ± 31.3＊＊＊蘆丁低劑量組 50 76.9 ± 11.6##蘆丁中劑量組 100 43.7 ± 23.4###蘆丁高劑量組 200 12.1 ± 8.3###

2.2 HE染色 假手術組胃黏膜未發現有病理學變化(圖1A);顯微鏡下觀察發現缺血再灌注組胃黏膜有胃黏膜糜爛、出血，局部腺體結構紊亂，間隙擴大，并有局部胃黏膜細胞脫落(圖1B);蘆丁高劑量組上皮基本完整、連續，腺體排列較整齊;胃黏膜充血較輕微(圖1C)。

2.3 蘆丁對大鼠缺血再灌注后胃黏膜SOD活性及MDA和NO含量的影響 如表2所示，缺血再灌注組在缺血再灌注后，胃黏膜組織中MDA和NO的含量較假手術組明顯升高(P＜0.001);SOD活力降低顯著(P＜0.001)。與缺血再灌注組比較，蘆丁低、中、高劑量組顯著降低受損胃黏膜組織中的MDA和NO的含量，同時顯著升高其SOD活力，結果見表2。

表2 蘆丁對大鼠缺血再灌注后胃黏膜SOD活性及MDA和NO含量的影響(±s，n=8)

表2 蘆丁對大鼠缺血再灌注后胃黏膜SOD活性及MDA和NO含量的影響(±s，n=8)

注:＊＊＊P ＜ 0.001，vs假手術組;#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001，vs缺血再灌注組。

組別 給藥劑量/mg·kg－1 SOD/U·mg－1 NO/μmol·g－1 MDA/nmol·(mg prot)－1假手術組 —167.30 ± 31.35 3.87 ± 1.08 2.50 ± 0.77缺血再灌注組 — 106.20 ± 29.63＊＊＊ 6.64 ± 1.73＊＊＊ 6.31 ± 1.62＊＊＊蘆丁低劑量組 50 126.47 ± 29.02 5.25 ± 1.19# 4.72 ± 1.11#蘆丁中劑量組 100 143.64 ± 29.61# 4.82 ± 1.21## 3.68 ± 1.03##蘆丁高劑量組 200 153.50 ± 24.59## 4.23 ± 0.87## 2.91 ± 1.54###

2.4 蘆丁對大鼠缺血再灌注后胃黏膜MPO活性的影響 缺血再灌注組大鼠缺血再灌注后，胃黏膜組織中MPO活性較假手術組顯著升高(P＜0.001)。與缺血再灌注組相比較，蘆丁低、中、高劑量組明顯地降低了大鼠胃黏膜組織MPO活性(P＜0.001)，見表3。

表3 蘆丁對大鼠缺血再灌注后胃黏膜MPO活性的影響(±s，n=8)

表3 蘆丁對大鼠缺血再灌注后胃黏膜MPO活性的影響(±s，n=8)

注:＊＊＊P ＜ 0.001，vs假手術組;###P ＜ 0.001，vs缺血再灌注組。

組別 給藥劑量/mg·kg－1 MPO/U·g －1假手術組 —2.73 ± 0.57缺血再灌注組 — 6.64 ± 1.38＊＊＊蘆丁低劑量組 50 3.31 ± 1.23###蘆丁中劑量組 100 2.93 ± 0.65###蘆丁高劑量組 200 2.21 ± 0.62###

2.5 蘆丁對大鼠缺血再灌注后胃黏膜組織NOS活性的影響 缺血再灌注組大鼠胃黏膜組織TNOS及iNOS活性明顯高于假手術組(P＜0.001)，cNOS活性明顯低于假手術組(P＜0.05)。缺血前給予蘆丁明顯降低了TNOS活性和iNOS活性，并顯著地增加了cNOS活性，結果見表4。

表4 蘆丁對大鼠缺血再灌注后胃黏膜組織NOS活性的影響(±s，n=8)

表4 蘆丁對大鼠缺血再灌注后胃黏膜組織NOS活性的影響(±s，n=8)

注:*P ＜ 0.05，＊＊＊ P ＜ 0.001，vs假手術組;#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001，vs缺血再灌注組。

組別 給藥劑量/mg·kg－1 TNOS活性/U·mg－1 iNOS活性/U·mg－1 cNOS活性/U·mg －1假手術組 —2.53 ± 0.62 0.06 ± 0.02 2.47 ± 0.58缺血再灌注組 — 4.99 ± 1.11＊＊＊ 3.25 ± 1.95＊＊＊ 1.53 ± 0.52*蘆丁低劑量組 50 3.89 ± 0.51## 1.74 ± 0.52### 2.29 ± 0.52#蘆丁中劑量組 100 3.42 ± 0.55### 0.93 ± 0.71### 2.54 ± 0.55#蘆丁高劑量組 200 2.89 ± 0.72### 0.53 ± 0.33### 2.45 ± 0.77#

2.6 蘆丁對胃黏液分泌的影響 與假手術組比較，缺血再灌注組胃壁黏液結合量明顯降低;與缺血再灌注組比較，蘆丁高劑量組胃壁黏液結合量明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05)，結果見表5。

表5 蘆丁對胃黏液分泌的影響(±s，n=8)

表5 蘆丁對胃黏液分泌的影響(±s，n=8)

注:＊＊ P ＜ 0.01，vs假手術組;#P ＜ 0.05，vs缺血再灌注組。

組別 給藥劑量/mg·kg－1胃黏液/mg假手術組 —3.27 ± 0.79缺血再灌注組 — 1.92 ±0.98＊＊蘆丁低劑量組 50 2.08 ± 0.64蘆丁中劑量組 100 2.49 ± 0.82蘆丁高劑量組 200 2.93 ± 0.95#

3 討論

缺血再灌注損傷特別是胃缺血再灌注損傷，是各種術后并發癥、合并癥的首要誘因，嚴重威脅了人類的健康。NO是由以L-精氨酸為底物在一氧化氮合酶(NOS)的催化下生成的一種重要的生物活性物質。研究證明，NOS在胃腸道廣泛存在，根據NOS來源和對鈣、鈣調蛋白(Ca2+/CaM)依賴性的不同以及是否受內毒素、細胞因子誘導等特點，NOS分為組成型NOS(constitutive NOS，cNOS)和iNOS近年來，cNOS又分為神經型nNOS和 eNOS(endothelial NOS，eNOS)。

多年來研究認為，NO是一種重要的胃黏膜保護因子，文獻報道其胃黏膜保護活性與其增加胃黏膜血流量有關［7］。然而，近年研究［2，8］顯示 NO 在胃GI/R時具有雙重功能，既有胃黏膜保護作用又有細胞毒作用。Gou等［1］研究發現大鼠胃缺血再灌注時胃黏膜組織中NO含量明顯增高，并發現缺血再灌注導致NO水平增加是由于胃黏膜組織中iNOS活性增高，造成NO水平快速升高，此時過度表達的NO可直接引起細胞毒作用或通過自由基氧化生成毒性更大的強氧化劑，從而導致能量代謝障礙使細胞死亡。因此，以NO的代謝為治療靶點，尋找療效更好的胃黏膜損傷治療藥物，具有重要的研究價值。

已有文獻報道［3］，蘆丁具有減輕冷凍—束縛應激引起的胃黏膜損傷效應［4］，且胃黏膜保護作用與其抗氧化應激活性有關。研究表明［3］，蘆丁對炎癥引起的NO過量生成具有抑制作用。本實驗結果顯示，蘆丁預處理可以降低大鼠GI/R損傷，抑制胃黏膜中TNOS和iNOS的活性增加，增加cNOS活性，降低胃黏膜組織MDA和NO含量;同時，研究發現蘆丁降低了胃黏膜組織中MPO活性，減少淋巴細胞對胃黏膜組織浸潤，減輕胃黏膜損傷。由此推斷，蘆丁可以抑制大鼠GI/R引起的胃黏膜組織氧化應激。此外，本研究表明，蘆丁可通過抑制胃黏膜TNOS和iNOS的活性增加，上調cNOS活性調節NO的生成，進而抑制淋巴細胞在胃黏膜組織中浸潤，發揮胃黏膜損傷治療作用。

有資料表明［9］，胃黏液分泌減少也是胃缺血再灌注導致胃黏膜損傷的一個重要誘因。胃黏液系胃黏膜表面覆蓋著的一層具有黏彈性和水不溶性的黏液凝膠，其主要成分為高分子量的黏蛋白，而cNOS來源的NO可調節黏液細胞的功能，促進胃黏液的分泌［10］。本文對胃壁黏液的含量也進行了檢測，結果發現，缺血再灌注組胃壁黏液較正常對照組含量有顯著減少，這與以前的報道相一致［10］;而蘆丁可以顯著增加胃黏液的含量，以增強潤滑與保護胃黏膜免遭機械損傷的作用;同時，由于該黏液的黏滯性，使H+在黏液中的擴散速度減慢，從而加強屏障作用。此外，蘆丁可以上調胃黏膜組織cNOS活性。本文推測，蘆丁增加胃黏液的含量可能與上調胃黏膜中cNOS活性，以致cNOS來源的NO的生成增加，進而導致促進胃黏液的合成與分泌。然而其具體機制，有待進一步的研究。

綜上所述，蘆丁對大鼠GI/R損傷胃黏膜具有保護作用，其保護作用的機制調節胃黏膜組織中cNOS/iNOS的活性，調節NO的生成，從而減輕淋巴細胞組織浸潤和促進胃壁黏液分泌有關。

［1］Gou LS，Zhang L，Yin C，et al.Protective effect of L－ citrulline against acute gastric mucosal lesions induced by ischemia－reperfusion in rats［J］.Canadian Journal of Physiology and Pharmacology，2011，89(5):317－327.

［2］Kobata A，Kotani T，Komatsu Y，et al.Dual action of nitric oxide in the pathogenesis of ischemia/reperfusion－induced mucosal injury in mouse stomach［J］.Degestion，2007，75(4):188－197.

［3］Guruvayoorppan C，Kuttan G.Rutin inhibits nitric oxide and tumor necrosis factor－alpha produ－ction in lipopolysaccharide and concanavalin－a stimulated macrophages［J］.Drug Metabol Drug Interact，2007，22(4):263－278.

［4］Zhao WZ，Wang YL，Chen ZW，et al.Study on protective effects of rutoside on gastric mucosa in rats［J］.Acta Universities Medicinalis Anhui，1998，33(2):93－ 95.

［5］Zhang JF，Zhang YM，Yan CD，et al.Protective effects of paraventricular nucleus stimulation and vasopression on gastric ischemiareperfusion injury in rats［J］.Acta Physiologica Sinica，2002，54(2):133－138.

［6］Bolton JP，Palmer D，Cohen MM.Stimulation of mucus and nonparietal cell secretion by the E2prostaglandins［J］.Am J Dig Dis，1978，23(4):359－364.

［7］Andrews FJ，Malcontenti－ Wilson C，O’Brien PE.Protection against gastric ischemia－reperfusion injury by nitric oxide generators［J］.Dig Dis Sci，1994，39(2):366－ 373.

［8］Gou L，Zhang L，Yin C，et al.Protective effect of L－ citrulline against acute gastric mucosal lesions induced by ischemia－reperfusion in rats［J］.Can J Physiol Pharmacol，2011，89(5):317－327.

［9］Kim HY，Kim KH.Role of nitric oxide and mucus in ischemia/reperfusion－induced gastric mucosal injury in rats［J］.Pharmacology，2001，62(4):200－207.

［10］Nishida K，Ohta Y，Ishiguro I.Preventive effect of teprenone on stress－induced gastric mucosal lesions and its relation to gastric mucosal constitutive nitric oxide synthase activity［J］.Phar－ macological Research，1999，39(4):325－332.