HPVE6／E7mRNA與宮頸病變關系的研究進展

王麗梅 徐 琳

1（云南省第一人民醫院 婦科，昆明650032）

2（昆明醫科大學 第一附屬醫院婦科，昆明650032）

宮頸癌是全球女性第二大常見的惡性腫瘤，全世界每年約有50萬宮頸癌新發病例，每年約有23萬女性死于宮頸癌。其中80%的病例發生在發展中國家［1］。我國每年約有8萬人死于宮頸癌，其死亡率為我國婦女惡性腫瘤第一位［2］。

經過大量流行病學和病毒學研究證實，高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續感染是宮頸癌發生和發展的首要因素。所以有效、積極地開展宮頸癌篩查，早期發現并及時干預，能夠顯著降低宮頸癌的發病率。由于E6和E7是HPV的癌基因，其表達必須通過E6／E7mRNA。因此2006年歐洲生殖器感染和腫瘤研究組織（European Research Organiza-tionon Genital Infection and Neoplasia，EUROGIN）取得了共識，認為HPV E6／E7mRNA檢測應作為宮頸癌篩查的重點研究內容［3］。本文就HPV E6／E7mRNA與宮頸病變關系的研究進展做一綜述。

1 HPVE6、E7mRNA檢測技術的發展

到目前為止，美國FDA相繼批準了4個宮頸癌高危HPV檢測，依次分別為基于雜交捕獲技術的Hybrid Capture 2，基于酶切信號放大技術的 Cervista HPV，基于實時熒光PCR技術的Cobas HPV，和基于轉錄介導等溫擴增技術的Aptima HPV。前三種HPV檢測是檢測HPV DNA，屬于第一代的高危HPV病毒檢測方法。80% 以上的婦女一生中都會有HPV病毒感染，只有不到10%左右的HPV感染會發展為持續性感染。這些持續感染HPV的婦女則成為宮頸癌的高危人群。第一代的HPV DNA檢測，雖然有較高的臨床敏感性，但是，其特異性較低，這主要是因為 HPV DNA是結構基因，一旦發生感染，就能被檢測到。而這些假陽性結果，會給患者帶來不必要的心理壓力，以及由此帶來后續不必要的創傷性檢查。

研究表明，HPV早期編碼區E6、E7基因是病毒的兩個關鍵致癌基因［4］。其通過轉錄mRNA實現癌蛋白的表達，從而改變細胞正常代謝，導致細胞發生病變直至癌變。在病毒感染的早期，病毒基因在細胞內為游離狀態，此時E6、E7基因處于靜默期，不表達或低表達mRNA，一過性HPV感染大多處于這個階段。當HPV病毒發生持續感染后，病毒基因和人類基因發生整合，利用宿主細胞大量轉錄mRNA、從而導致大量癌蛋白的表達。所以癌基因E6、E7的表達是宮頸上皮內瘤變和宮頸癌發生的必要步驟，其表達產物E6、E7蛋白是致癌的關鍵。所以檢測高危型HPV病毒的E6、E7mRNA相比檢測HPV DNA，可以更加精準的篩查病變，有效降低對一過性感染的檢出率。

2 HPVE6、E7基因的致癌機理

HPV病毒屬于乳頭多瘤空泡病毒科病毒屬，是一種小型、無外包膜的環狀DNA病毒。包括3個部分：早期基因區（E）、晚期基因區（L）及長控制區（LCR）。其中，早期基因區可以編碼 E1、E2、E6、E7等早期蛋白，E6、E7是主要的致癌基因；晚期基因區編碼的后期蛋白質（L1和L2）病毒衣殼是結構性的組成部分，在病毒顆粒自我組裝以及侵入目標細胞時起協調和識別作用。

而早期區（E區）編碼蛋白基因中，由E6和E7基因編碼的致癌蛋白是導致宮頸上皮癌變的重要因子，這兩種蛋白通過抑制兩種主要抑癌蛋白p53和視網膜母細胞瘤蛋白（pRb）使被感染的細胞可無限增殖并惡性轉變。E6蛋白通過E6相關蛋白（E6-AP）介導與抑癌蛋白p53結合，經過泛素途徑使其降解，使細胞繞過細胞周期G1／S和G2／M檢查點而轉向惡性增殖。另外，E6通過阻斷p53依賴的細胞凋亡途徑阻止細胞凋亡，使基因異常的細胞得以持續增殖，最終導致細胞永生化和宮頸癌的發生［5］。E7蛋白可特異性結合視網膜母細胞瘤蛋白（pRb），pRb最重要的功能是與細胞轉錄因子E2F結合形成特異性pRb／E2F復合物，后者可以作為轉錄抑制因子，負向調控G1／S期的轉變，抑制細胞周期的進展。E7蛋白特異性結合pRb后導致pRb／E2F復合物無法形成，從而促進G1／S期的轉變和細胞分裂增殖加速［6］。

此外，E7蛋白也可使細胞周期相關負向調節因子p27和p16失活，使細胞生長停滯信號受到抑制，造成細胞周期紊亂，引起細胞無限增殖并向惡性轉化。E6、E7聯合作用可使有絲分裂紡錘體形成缺陷和中心體數目異常，導致染色體異常、基因不完整以及多倍體細胞的出現，促使細胞惡變和腫瘤的發生。有研究［7］表明：通過干擾RNA沉默E6、E7基因可抑制宮頸癌細胞的生長，并引起癌細胞凋亡；此外，HPV E6和E7癌基因在宮頸癌的浸潤轉移中起著重要作用，E6和E7與上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition，EMT）密切相關。EMT是惡性腫瘤浸潤轉移的重要機制，通過下調黏附分子的表達使細胞間接觸力降低同時細胞流動性增強，使惡性腫瘤細胞遠處轉移。E6和E7通過激活EMT轉錄因子Slug、Twist、ZEB1和ZEB2，使細胞發生EMT樣改變，增強惡性細胞的侵襲力，使惡性細胞浸潤轉移［8］。同時，E6和E7還可影響宿主的免疫功能，抑制干擾素應答啟動，導致病毒逃逸免疫系統的監視，促進腫瘤的進展［9］。

3 HPVE6／E7mRNA在低度宮頸病變中的應用

目前，HPV檢測大多數針對病毒DNA，HPV DNA檢測用于宮頸癌篩查的敏感度和特異性都高于細胞學檢查。美國陰道鏡和宮頸病理學會定期用HPV-DNA分型檢測對30歲以上的婦女進行宮頸癌篩查。發現HPV-DNA分型檢測過程中出現較高的假陰性現象，而且假陰性現象隨著年齡增長而增加［10］。因此，HPV DNA檢測對宮頸病變的風險預測過早。而癌基因E6和E7的表達是導致宮頸細胞惡性轉化并發展至宮頸癌的必要步驟，相對于HPV DNA檢測，E6／E7mRNA檢測能夠更精確地預測細胞向高度病變和癌癥轉變的可能性。研究證實HPV的基因表達只有一條途徑（先轉錄，再翻譯），轉錄產物E6／E7mRNA反映了基因表達的活性，因此，檢測E6／E7mRNA是了解HPV表達情況的有效途徑，其將是研究宮頸癌的主要方式。同時聯合TCT可以有效地提高宮頸癌的準確率，排除假陰性患者［11］。Rossi等［12］提出陰道鏡下活檢結果為CIN1或正常的mRNA陽性婦女和mRNA陰性的婦女進展為CIN2＋的概率分別為每年18．4‰和3．6／‰。

王少蕾等［13］利用bDNA技術檢測480例ASCUS以上（含ASCUS）的TCT標本進行了HPV E6／E7mRNA檢測顯示，細胞學嚴重程度的增加，E6／E7mRNA的表達同時增加，隨著細胞病理學病變程度的增高，陽性率隨之提高。27例癌的標本中，HPV E6／E7mRNA檢測均為陽性，拷貝值較高。Tinelli等［14］的一項隨訪研究發現，mRNA陽性而活檢正常的婦女進展為CIN的平均時間為12個月。因此，在細胞學和HPV DNA檢測基礎上再行E6／E7mRNA檢測，根據E6／E7mRNA結果對婦女進行分層管理并制定個性化的篩查間隔時間可能更為合理，可降低宮頸病變的漏診率，優于單獨檢測，可避免過度頻繁的檢查給患者帶來的經濟和心理負擔。

4 HPV E6／E7mRNA在CINII及以上病變中的診斷價值

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，HPV感染是宮頸癌發生的主要危險因素。幾乎100%的高級別CIN以及宮頸癌都合并HPV感染［15］。目前，用于宮頸癌篩查的主要是細胞學聯合HPV DNA檢測，兩者的檢測結果不能給出病變的明確級別。研究證實細胞學和HPV DNA檢測的特異度和陽性預測值低于HPV E6／E7mRNA檢測［16］。Benevolo等［17］對489例細胞學異常和 HPV DNA陽性的婦女進行E6／E7mRNA檢測和陰道鏡活檢，發現217例mRNA陽性的婦女中有121例活檢結果為CIN2＋，272例mRNA陰性的婦女中僅53例活檢結果為CIN2＋。研究證實：Aptima檢測技術對診斷CIN2＋ （CIN2、CIN3和宮頸癌）的特異度和陽性預測值比第2代雜交捕獲試驗（HC2）和液基細胞學檢測更高［18］。黃凌霄等［19］對426例患者研究發現 HPV E6／E7mRNA預測ASCUS患者CINII＋的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為 90．0%、64．2%、54．2%、93．2%。與HR-HPV DNA檢測相比，其特異度和陽性預測值均較高，靈敏度、陰性預測值相近。

HPV DNA檢測現廣泛用于宮頸病變的篩查和隨訪，尤其是在ASCUS患者的分流中有重要作用。有研究發現，HPV E6／E7mRNA水平與組織學病變程度之間存在正相關性。因此在宮頸篩查過程中，HPV E6／E7mRNA水平越高，更需警惕宮頸病變甚至是宮頸癌的可能。因此，若將E6／E7mRNA作為宮頸癌的二線篩查方案，可更有效地篩查宮頸癌。

5 HPVE6／E7mRNA在CIN患者術后隨訪中的應用

宮頸錐切術是治療CIN2＋的主要方法，但CIN病灶不完全清除仍會導致宮頸癌的發生，CIN經宮頸錐切術后殘留及復發率很高，對于宮頸病變切緣陰性的患者，約25%患者出現殘留或復發［20］。因此對于CIN患者的術后隨訪尤為重要。目前對于CIN治療后的隨訪內容主要是細胞學和HPV DNA檢測，但兩者對于預測術后病灶復發的敏感度高而特異度低，導致臨床醫師的過度診斷和過度治療。因此有學者提出將HPVmRNA檢測用于CIN術后隨訪，但對于其預測術后復發的能力仍存在著爭議。Frega等［21］認為其敏感度和陰性預測值高于HPV DNA檢測，HPV mRNA用于預測宮頸病變復發的敏感度為 73．5%，陰性預測值為 97．0%，HPV DNA則分別為44．0% 和93．0%；但Zappacosta等［22］的研究證實：HPVE6／E7mRNA 預測CIN術后復發的特異度和陽性預測值高于細胞學聯合HPV DNA檢測，認為HPVmRNA能夠更早且更為有效地預測術后病灶復發。李梅等［23］研究證實TCT、HPVE6／E7mRNA聯合檢測，可提高檢測的敏感性，同時發揮E6／E7mRNA檢測的特異性，避免過度診斷和治療，減輕患者經濟負擔及心理負擔。

6 結語

宮頸癌是一種嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤之一，也是目前惟一可以預防的婦科惡性腫瘤，通過早期篩查及干預可以有效地阻止CIN向宮頸癌進展。HPV與宮頸癌的關系密切，HPV癌基因E6和E7在宮頸癌的發生和發展中發揮重要作用。目前已有多個國家開始進行宮頸HPV E6／E7mRNA大規模篩查，并積累大量臨床資料。同時證實HPV E6／E7mRNA是宮頸細胞癌變的重要因素，HPV E6／E7mRNA檢測不僅對ASCUS患者高級別病變具有較高的辨別能力，能更好地篩選出高危人群，其對判斷宮頸HPV感染階段、預測宮頸病變進展風險以及判斷宮頸病變的嚴重程度具有重要價值。雖然，隨著此類技術的不斷更新，HPV E6／E7mRNA作為新的病毒分子對病毒癌基因活性的有比較直觀反應，大大提高了HPV檢測的敏感性、特異性、但其臨床應用推廣尚需大樣本量的隨機對照試驗以及長期的隨訪。

［1］ Parkin DM．The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002［J］．Int J Cancer，2006，118（12）：3030-3044．

［2］ Wan L，Wan JP，Zhang YL，et al．Clinical Analysis of the Trend of Carcinoma of the Cervix in Young Women［J］．Chinese Journal of Clinical Oncology，2004，31（10）：547．

［3］ Cuschieri K，Wentzensen N．Human papillomavirus mRNA and p16detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical neoplasia［J］．Cancer Epidem Biomar，2008，17（10）：2536-2545．

［4］ Hovland S，Muller S，Skomedal H，et al．E6／E7mRNA expression analysis：a test for the objective assessment of cervical adenocar cinomain clinical prognostic procedure［J］．Int J Oncol，2010，36（6）1533-1539．

［5］ Werness BA，Levine AJ，Howley PM．Association of human papillomavirus types 16and 18E6proteins with p53［J］．Science，1990，248（4951）：76-79．

［6］ McLaughlin-Drubin ME，Münger K．The human papillomavirus E7oncoprotein［J］．Virology，2009，384（2）：335-344．

［7］ 彭嬋娟，葉楓，謝幸．RNA干擾在宮頸癌HPV16E6／E7中的研究進展［J］．國際腫瘤學雜志，2011，38（4）：300-303．

［8］ Jung YS，Kato I，Kim HRC．A novel function of HPV16-E6／E7in epithelial-mesenchymal transition［J］．Bioche Bioph Res Co，2013，435（3）：339-344．

［9］ Ghittoni R，Accardi R，Hasan U，et al．The biological properties of E6and E7oncoproteins from human papillomaviruses［J］．Virus Genes，2010，40（1）：1-13．

［10］ 朱曉敏．LCT、HPV檢測及宮頸多點活檢在宮頸癌篩查的應用［J］．中國社區醫師（醫學專業），2012，14（26）：229-230．

［11］ 芮平．HPV-DNA亞型檢測聯合液基細胞學對宮頸癌篩查的臨床價值［J］．中國性科學，2012，21（7）：48-50．

［12］ Rossi PG，Benevolo M，Vocaturo A，et al．Prognostic value of HPV E6／E7mRNA assay in women with negative colposcopy or CIN1histology result：a follow-up study［J］．PLoS One，2013，8（2）：e57600．

［13］ 王少蕾，王筱紅．480例膜式液基薄層細胞學檢測標本中人乳頭瘤病毒E6／E7mRNA的檢測與分析．中國婦幼保健2014，（29）18：2986-2987．

［14］ Tinelli A，Guido M，Zizza A，et al．The mRNA-HPV Test U-tilization in the Follow Up of HPV Related Cervical Lesions［J］．Curr Pharm Design，2013，19（8）：1458-1465．

［15］ Dogan NU，Salman MC，Yuce K．The role of HPV DNA testing in the follow-up of cervical intraepithelial neoplasia after loop electrosurgical excision procedure［J］．Arch Gynecol Obstet，2011，283（4）：871-877．

［16］ Burger EA，Korn?r H，Klemp M，et al．HPV mRNA tests for the detection of cervical intraepithelial neoplasia：a systematic review［J］．Gynecol Oncol，2011，120（3）：430-438．

［17］ Benevolo M，Vocaturo A，Caraceni D，et al．Sensitivity，specificity，and clinical value of human papillomavirus（HPV）E6／E7mRNA assay as a triage test for cervical cytology and HPV DNA test［J］．J Clin Microbiol，2011，49（7）：2643-2650．

［18］ Dockter J，Schroder A，Hill C，et al．Clinical performance of the APTIMA HPV Assay for the detection of high-risk HPV and highgrade cervical lesions［J］．J Clin Virol，2009，45（1）：S55-S61．

［19］ 黃凌霄，潘瓊慧，鄭建瓊，朱雪燕，朱雪瓊2HPV E6／E7mRNA在CINII及以上病變中的診斷價值．溫州醫科大學報，2015，45（8）：583-587．

［20］ 孟化民．HPV檢測在宮頸病變診斷及CIN術后隨訪中的價值分析［J］．繼續醫學教育，2013，27（9）：24-25．

［21］ Frega A，Sesti F，Lombardi D，et al．Assessment of HPV-mRNA test to predict recurrent disease in patients previously treated for CIN2／3［J］．J ClinVirol，2014，17（1）：1386-1393．

［22］ Zappacosta R，Ianieri MM，Tinelli A，et al．Detection of residual／recurrent cervical disease after successful LEEP conization：the possible role of mRNA-HPV test［J］．Curr Pharm Design，2013，19（8）：1450-1457．

［23］ 李梅，楊素芬，葉瑞勉，張燕科．HPV E6／E7mRNA檢測聯合液基細胞學檢查對宮頸上皮內瘤變Ⅱ～Ⅲ級術后的隨訪價值．全科醫學臨床與教育，2015，13（3）：272-277．