動、靜脈移植骨髓間充質干細胞治療急性期缺血再灌注大鼠模型的比較

屈新輝　王萬松　吳凌峰　謝　琛　張昆南　吳曉牧

(江西省人民醫院神經內科　江西省神經病學研究所,江西　南昌　330006)

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動、靜脈移植骨髓間充質干細胞治療急性期缺血再灌注大鼠模型的比較

屈新輝王萬松1吳凌峰謝琛張昆南吳曉牧

(江西省人民醫院神經內科江西省神經病學研究所,江西南昌330006)

摘要〔〕目的探討缺血再灌注6 h后經動、靜脈途徑移植骨髓間充質干細胞療效的差異。方法將27只大腦中動脈缺血2 h后再灌注SD雌性大鼠模型隨機分為頸動脈BMSCs組8只、尾靜脈BMSCs組7只、頸動脈PBS組6只和尾靜脈PBS組6只。全骨髓貼壁法分離、培養BMSCs，流式細胞儀檢測鑒定；取缺血再灌注后6 h為移植時間點；移植后第7天觀察改良神經功能損傷評分(mNSS)以評價神經功能恢復和體能恢復，免疫組織化學檢測梗死周圍組織GFAP、Bax和Bcl-2，TUNEL法檢測梗死周圍組織細胞凋亡，ELISA檢測血清腫瘤壞死因子(TNF)-α。結果BMSCs表面抗原CD90表達率為95.7%、CD29表達率為97.3%、CD106表達率為52.7%、CD11b表達率為6.01%、CD34表達率為2.95%、CD45表達率為2.26%。BMSCs組和PBS組相比較：GFAP陽性細胞數、Bcl-2平均光密度值顯著增多；mNSS、血清TNF-α濃度、TUNEL陽性細胞數顯著減少；Bax平均光密度值無明顯差異。頸動脈BMSCs組和尾靜脈BMSCs相比較各項數據無統計學差異。結論在缺血再灌注早期動、靜脈途徑移植BMSCs療效無差異，但尾靜脈途徑因創傷微小、可移植細胞量多，為早期最佳移植途徑。

關鍵詞〔〕骨髓間充質干細胞；缺血再灌注；腦梗死；移植；凋亡

1南昌大學醫學院(現南昌大學第一附屬醫院康復科)

第一作者：屈新輝(1970-)，男，碩士，碩士生導師，主任醫師，主要從事腦血管病和干細胞研究。

骨髓間充質干細胞(BMSCs)因來源穩定、取材方便、易于擴增、低免疫源性且無道德倫理沖突而廣泛運用于組織修復和再生領域，其中包括發病率、致死和致殘率極高的腦梗死。大量的BMSCs治療腦梗死實驗證明，BMSCs能有效促進腦梗死組織修復和神經功能缺損癥狀的改善〔1〕，但具體機制仍不明了。目前對于最佳移植時間點和最佳移植途徑仍存在爭議。本實驗擬研究缺血再灌注6 h后分別經動、靜脈移植BMSCs的療效差異和具體機制。

1材料和方法

1.1BMSCs的分離、培養、擴增和鑒定3～4周齡清潔級SD幼鼠脫臼處死，75%醫用酒精浸泡10 min，于超凈臺中分離股骨和脛骨，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗殘留組織后去除兩端骨骺，用無菌注射器吸取適量含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養基混合液反復沖洗骨髓腔，將骨髓吹打均勻后接種于25 cm2細胞培養瓶，置于37℃和5%CO2的細胞孵育培養箱中，24 h后半量換液，2 d后全量換液，以后每2～3 d換液一次。觀察細胞密度接近90%時按1∶2傳代培養、擴增。

選取第二代細胞用含0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化，4℃條件下1 000 r/min離心，棄去上清液后PBS清洗，PBS調整細胞密度為1×106，行細胞表面抗原CD29、CD90、CD106、CD34、CD45、CD11b(Biolegend公司)及同型對照避光孵育，1 000 r/min離心，棄去上清液，PBS重懸為1 ml上機液行流式檢測。

1.2線栓法大鼠腦缺血模型(MCAO)的制作選用體重250～280 g的清潔級SD雌性大鼠(湖南斯萊克景達公司)，10%水合氯醛按0.3 ml/100 g劑量腹腔麻醉。仰臥位固定四肢及頭部，頸部前正中切口，鈍性分離頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈和迷走神經。夾閉頸總動脈和頸內動脈，結扎并剪斷頸外動脈。采用直徑為0.26 mm、線頭直徑為0.36 mm的尼龍線(北京西濃生物科技有限公司)從頸外動脈殘端插入頸內動脈，插入深度約為18 mm，稍遇阻力即停止。阻斷大腦中動脈血流2 h后緩慢拔出栓線以解除梗阻再通血流。

1.3移植將MACO模型按隨機數字表分為頸動脈BMSCs組(n=8)、尾靜脈BMSCs組(n=7)、頸動脈PBS組(n=6)和尾靜脈PBS組(n=6)。頸動脈BMSCs組和頸動脈PBS組經如下處理：10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，打開原切口，鈍性分離頸總動脈和頸內動脈，將PE50導管由頸外動脈殘端插入頸內動脈，分別推注含1×106BMSCs的細胞懸浮液500 μl和PBS 500 μl，棉簽按壓，縫合切口。尾靜脈BMSCs組和尾靜脈PBS組處理如下：固定大鼠，溫水浸泡鼠尾5 min，酒精反復擦拭，1 ml注射器推注含1×106BMSCs的細胞懸浮液500 μl和PBS 500 μl，棉簽按壓。所有大鼠自由攝取食物和飲水，移植條件相對無菌，未給予抗生素處理。

1.4神經功能缺損檢測在缺血再灌注后6 h和移植后第7天對大鼠行改良神經功能缺損評分(mNSS)，總分18分，神經功能缺損越嚴重得分越高。評分7～12分即納入實驗分組。

1.5免疫組化檢測移植后第7天處死大鼠，心尖采血，4%多聚甲醛固定并取腦，4℃ 4%多聚甲醛固定過夜，冠狀位將腦梗死部位切為2 mm厚的腦片，脫水并石蠟包埋。將蠟塊切為4 μm厚的切片，脫蠟至水，檸檬酸鈉修復，3%H2O2滅活，滴加一抗，神經膠質酸性蛋白(GFAP，1∶3 000，abcam)、血管內皮生長因子(VEGF，1∶100，abcam)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2，1∶100，abcam)基因蛋白、Bcl-2相關x蛋白(Bax，1∶100，abcam)，4℃過夜，二抗孵育，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素核染。脫水透明，封片。

1.6細胞凋亡檢測采用商品試劑盒(Roche)檢測細胞凋亡，按照說明書操作。

1.7細胞因子檢測將心尖采取的血液室溫靜置2 h，2 000 r/min離心10 min，分裝血清于-80℃凍存，檢測時室溫解凍。按ELISA商品試劑盒(上海西塘)說明書操作。

1.8圖片采集和分析采用醫學光學顯微鏡(OLYMPUS，×40物鏡)和Image Pro Plus6.0軟件采集分析圖片，每張玻片于缺血半暗帶處取6張圖片，計平均光密度值和陽性細胞數。

1.9統計學方法應用SPSS19.0軟件行單因素方差分析，若數據方差齊性，采用LSD法行均數兩兩比較；方差不齊則采用Dunnett T3法分析。

2結果

2.1BMSCs鑒定BMSCs體外呈紡錘狀長梭形，貼壁集落生長。細胞表面抗原鑒定結果：CD90表達率為95.7%、CD29表達率為97.3%、CD106表達率為52.7%、CD11b表達率為6.01%、CD34表達率為2.95%、CD45表達率為2.26%。

2.2mNSS測定及比較移植前，頸動脈BMSCs組mNSS為9.35±0.92，尾靜脈BMSCs組為9.14±1.06，頸動脈PBS組為9±1.2，尾靜脈PBS組為9.17±0.75，四組評分無統計學差異。移植后第7天，頸動脈BMSCs組mNSS(5.13±0.64)顯著小于頸動脈PBS組(6.57±0.58)，尾靜脈BMSCs組mNSS(5.14±0.69)顯著小于尾靜脈PBS組，頸動脈BMSCs組和尾靜脈BMSCs組mNSS無統計學差異。

2.3免疫組化檢測結果比較①頸動脈BMSCs組GFAP陽性細胞數(45.38±7.11)顯著高于頸動脈PBS組(35.33±3.61)，尾靜脈BMSCs組(47±6.27)顯著高于尾靜脈PBS組(34±4.34)，頸動脈BMSCs組和尾靜脈BMSCs組GFAP陽性細胞數無統計學差異。②頸動脈BMSCs組Bcl-2平均光密度值(222.9±22.63)顯著高于頸動脈PBS組(195.26±12.94)，尾靜脈BMSCs組(224.36±17.24)顯著高于尾靜脈PBS組(190.63±18.46)，頸動脈BMSCs組和尾靜脈BMSCs組Bcl-2平均光密度值無統計學差異。③Bax平均光密度值頸動脈BMSCs組(215.09±36.81)、尾靜脈BMSCs組(218.29±42.65)、頸動脈BMSCs組(231.47±46.23)和尾靜脈PBS組(230.1±52.17)比較，組間無統計學差異，但BMSCs組Bax平均光密度值較PBS組有減小趨勢。見圖1～圖3。

圖1　GFAP表達情況(×400)

圖2　Bcl-2表達情況(×400)

圖3　Bax表達情況(×400)

2.4dUTP缺口末端標記測定法(TUNEL)檢測結果比較圖4可見，頸動脈BMSCs組TUNEL陽性細胞數(60.75±16.27)顯著低于頸動脈PBS組(77.5±10.6)，尾靜脈BMSCs組TUNEL陽性細胞數(58.71±7.16)顯著低于尾靜脈PBS組(76.67±15.65)，頸動脈BMSCs組和尾靜脈BMSCs組TUNEL陽性細胞數無統計學差異。

2.5血清腫瘤壞死因子(TNF)-α頸動脈BMSCs組血清TNF-α濃度值〔(31.8±14.72)pg/ml〕顯著低于頸動脈PBS組〔(55.31±8.35)pg/ml〕，尾靜脈BMSCs組TNF-α濃度值〔(35.36±9.57)pg/ml〕顯著低于尾靜脈PBS組〔(49.02±9.67)pg/ml〕，頸動脈BMSCs組和尾靜脈BMSCs組血清TNF-α濃度值無統計學差異，頸動脈PBS組較尾靜脈PBS組血清TNF-α濃度值有增高趨勢，但無統計學差異。

圖4　TUNEL表達情況(×400)

3討論

腦梗死是因缺血缺氧導致的缺血級聯反應，以梗死中心細胞不可逆壞死和缺血半暗帶受損細胞凋亡為特征。缺血再灌注后高水平的興奮性毒性物質、鈣超載、自由基和外周循環炎癥細胞的激活、浸潤導致二次損傷，加速缺血半暗帶處細胞凋亡，促使梗死區的進一步擴大。本課題組前期實驗證實缺血再灌注后持續高水平的炎癥介質和缺血半暗帶處的細胞凋亡密切相關，并加劇神經功能缺損〔2〕?？梢?，修復缺血半暗帶是改善腦梗死預后的重點。

缺血再灌注后，TNF-α主要由活化的小膠質細胞和單核/巨噬細胞分泌〔3〕。作為極其重要的促炎因子，TNF-α可通過多重機制參與腦梗死后炎癥的損傷和修復。TNF-α可破壞血腦屏障，誘導血管內皮細胞上調表達黏附分子，易化外周循環炎癥細胞滲透浸潤病灶〔4〕，加劇損害。Arango-Dvila等〔5〕發現減少TNF-α含量可有效減少梗死體積。但實驗亦發現TNF-α具有神經保護作用。Merrill等〔6〕指出TNF-α可刺激星型膠質細胞增生以促進梗死病灶修復。另有文獻報道腦梗死后小膠質細胞源性TNF-α通過TNF-p55R這一受體介導神經保護作用，但巨噬細胞源性TNF-α和其他TNF受體并無該作用〔7〕。TNF來源以及TNF受體的差異可能導致了TNF同時具有神經保護和神經損害作用。研究發現體外將BMSCs和活化的巨噬細胞共培養，BMSCs可通過旁分泌具有炎癥調節作用的轉化生長因子(TGF)-1和前列腺素E2等各種因子顯著減少巨噬細胞源性TNF分泌量〔8〕。本實驗發現移植BMSCs后TNF-α量顯著減少，這可能主要降低了巨噬細胞源性TNF-α，改變了不同來源TNF-α的含量比，從而改善神經功能。而頸動脈PBS組TNF-α濃度增高趨勢可能和移植造成的血管損傷及手術創傷有關。

腦梗死后活化的星型膠質細胞高表達巢蛋白、波形蛋白和膠質纖維蛋白，出現特殊的形態和功能改變〔9〕。其可調節K+濃度和酸堿平衡、攝取超量的谷氨酸、對抗谷氨酸的神經毒性〔10〕，改善病灶局部微環境，有利于病灶修復；其還可旁分泌腦源性神經生長因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、VEGF等多種營養和生長因子〔11〕，可營養支持受損細胞，促進神經發生和血管再生。本實驗發現移植BMSCs后活化的星型膠質細胞增多，但其具體機制有待進一步探討。研究表明移植BMSCs后可促進活化的星型膠質細胞分泌膠質細胞源性神經生長因子(GDNF)〔12〕，強化星型膠質細胞的營養支持作用。但星型膠質細胞也可成為損害因素。過量活化的星形膠質細胞亦可釋放促炎因子，形成膠質瘢痕，抑制軸突生長。實驗發現BMSCs和星型膠質細胞在內毒素環境下共培養可減少TNF-α的分泌〔13〕，還誘導星型膠質細胞增殖周期停止，避免形成過多的膠質瘢痕〔14〕。BMSCs可減少星型膠質細胞對腦梗死的不利影響，增強其對病灶的支持修復功能。

眾多學者通過各種途徑移植BMSCs治療腦梗死，雖然都有效改善神經功能缺損癥狀。但具體機制存在爭議。最初認為其關鍵機制是BMSCs分化為神經細胞以替代缺損的細胞。但實驗發現移植后僅少數BMSCs表達神經細胞表面標志物，且尚不能證明其具有相應的功能〔15〕。Heo等〔16〕將BMSCs誘導為神經元樣細胞通過立體定向途徑移植，卻未發現BMSCs分化為神經細胞，但能強烈抑制炎癥以促進神經功能恢復。為此，BMSCs可能通過其他機制發揮療效。本實驗也發現移植BMSCs后可減少細胞凋亡，并改善神經功能缺損癥狀。進一步研究發現移植BMSCs后Bcl-2表達上調。Bcl-2可穩定線粒體外膜，調節鈣超載，抑制促凋亡蛋白Bax，遏制凋亡的進展?？沟蛲鲎饔每赡苁荁MSCs的治療機制之一。文獻證實BMSCs可下調Bax的表達〔17〕，但本研究發現BMSCs組和PBS組相比，Bax表達雖有減少趨勢，但并無差異，這可能和觀察樣本數量較少和觀察時間稍短相關。

除了BMSCs治療腦梗死具體機制尚不明了外，最佳移植途徑也尚無結論。目前最常用的移植途徑主要有立體定向、動脈和靜脈途徑。立體定向途徑雖然可最大程度向病灶提供BMSCs，減少干細胞的流失，但其操作復雜、損傷較大、可有顱內壓增高、移植部位水腫壓迫等并發癥和副作用，較難開展。而動靜脈途徑可操作性強、創傷較小，臨床易于開展和接受。

頸動脈途徑的最大優點在于避開外周器官的首過消除作用，進入病灶的細胞數量較尾靜脈途徑多〔18〕；但其缺點在于移植的細胞易形成細胞栓子，梗阻相應供血區域微小血管，這一潛在風險制約了移植細胞劑量的增多。尾靜脈途徑的優點在于創傷微小，可移植細胞劑量較大；其最大缺點在于外周器官滯留了大量細胞，進入病灶細胞稀少〔19〕?；谏鲜鰞灹颖容^，Yang等〔20〕發現頸動脈途徑療效優于尾靜脈途徑。但本實驗研究發現頸動脈途徑和尾靜脈途徑移植BMSCs治療腦梗死療效并無差異。原因可能是：(1)動靜脈途徑造成干細胞在病灶內數量的差異并不足以造成療效的差異；(2)靜脈途徑移植的干細胞可在血腦屏障破壞和趨化因子的作用下持續遷徙至病灶處并發揮療效，以彌補首過消除的影響；(3)干細胞可以在外周通過旁分泌抗炎介質和營養因子發揮療效〔20〕，并不需要進入微環境惡劣的病灶。

綜上所述，BMSCs可通過減少缺血半暗帶細胞凋亡改善神經功能缺損癥狀。在缺血再灌注后6 h經頸動脈和尾靜脈途徑移植BMSCs療效無差異。但尾靜脈途徑創傷微小，可移植細胞量多，為腦梗死早期最佳移植途徑。

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〔2015-03-17修回〕

(編輯袁左鳴)

·基礎研究·

Comparison of intravenous and intracarotid route for bone marrow derived mesenchymal stem cells in the treatment of acute ischemia reperfusion in rat model

QU Xin-Hui,WANG Wan-Song,WU Ling-Feng,etal.

Jiangxi Province People's Hospital,Nanchang 330006,Jiangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the difference between intravenous and intracarotidroute for bone marrow derived mesenchymal stem cells at the treatment of MCAO 6 hours.MethodsTwenty seven female Sprague-Dawley rat models of MCAO were divided randomly into intracarotid BMSCs group(n=8),intravenous BMSCs group(n=7),intracarotid PBS group(n=6)and intravenous PBS group(n=6).BMSCs were isolated and cultured by whole bone marrow adherent culture and identified by flow cytometry.Transplantion was operated at MCAO 6 hours,7 days after transplantation,the neurological function and physical recovery were evaluated the modified neurological severity score(mNSS),GFAP,Bcl-2 and Bax levels were detected by immunohistochemistry,cell apoptosis was detected by TUNEL staining and TNF-α was detected by ELISA.ResultsThe expression of surface antigen CD90,CD29,CD106,CD11b,CD34,CD45 were respectively 95.7%,97.3%,52.7%,6.01%,2.95%,2.26%.Compared with those of PBS groups,the number of GFAP positive cells and Bcl-2 positive cells were significantly increased,the scores of mNSS and the number of TUNEL positive cells and the concentration of serum TNF-α were significantly decreased in BMSCs groups.The number of Bax positive cells was not significantly different among all groups.The difference between intracarotid and intravenous BMSCs group was not showed.ConclusionsThere is no difference between intravenous and intra-arterial route for bone marrow derived mesenchymal stem cells at the treatment of MCAO 6 hours,the intravenous route is optimal for tiny invasion and high dose of cells.

【Key words】BMSCs；Ischemia-reperfusion cerebral infarction；Transplantation apoptosis

通訊作者：吳曉牧(1958-)，男，博士，博士生導師，主任醫師，主要從事神經免疫和干細胞研究。

基金項目：國家自然科學基金資助課題(No.811160248)；江西省自然科學基金資助課題(No.20114BAB205061)

中圖分類號〔〕R74.3〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-6965-05；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.001