普伐他汀對人胰腺癌細胞SW1990的影響及其協同吉西他濱的抑瘤作用

張敏

[摘要] 目的 研究普伐他?。╬ravastatin，Pra）對人胰腺癌細胞SW1990增殖和凋亡的影響及其聯合吉西他濱（gemcitabine，GEM）對該細胞的作用。 方法 MTT比色法測定普伐他汀對SW1990細胞生長的抑制作用。不同濃度普伐他汀處理細胞48 h后，流式細胞儀測定細胞凋亡率，光學顯微鏡下觀察細胞形態學改變。吉西他濱、普伐他汀聯合吉西他濱作用細胞48 h，MTT法測定各處理組的OD值，并計算相互作用指數。 結果 MTT比色法顯示普伐他汀對SW1990細胞具有抑制增殖的作用，5、15、25 μmol/L普伐他汀處理SW1990細胞后，SW1990細胞出現典型的形態學改變，且凋亡百分率隨濃度增大而逐漸增加。普伐他汀聯合吉西他濱作用細胞后，GEM的IC50值降低。結論 普伐他汀具有抑制胰腺癌細胞SW1990增殖和誘導該細胞凋亡的作用，普伐他汀聯合吉西他濱對SW1990細胞具有協同抗瘤作用。

[關鍵詞] 普伐他??；吉西他濱；胰腺癌；增殖；凋亡；SW1990

[中圖分類號] R735.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）27-0009-04

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，在歐美等西方發達國家發病率高，致死率在美國僅次于結腸癌居第4位[1]。近年來，隨著環境污染加重、飲食結構調整及糖尿病年輕化等原因，我國胰腺癌發病率呈明顯上升趨勢[2]。胰腺癌起病隱匿，進展迅速，確診時超過80%的患者已屬中晚期而失去手術機會，需采用以化療為主的綜合治療手段。吉西他濱為脫氧胞苷類似物，是治療進展期和轉移性胰腺癌的一線標準藥物，但有效率不高，且易發生耐藥。如何提高化療藥物的敏感性并逆轉耐藥，是目前胰腺癌治療領域研究的難點和熱點。他汀類藥物通過抑制內源性膽固醇合成的限速酶——羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶，具有降低細胞內膽固醇合成的作用，是臨床治療高脂血癥的主要藥物[3]，廣泛用于治療和預防其他心腦血管疾病[4]。越來越多的研究發現，他汀類藥物除降膽固醇作用外，還可抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡，并能增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。本實驗初步研究了普伐他汀對人胰腺SW1990細胞的體外作用及其協同吉西他濱的抗瘤作用。

1材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人胰腺癌細胞株SW1990購自中國科學院細胞研究所。普伐他汀購自Sigma公司，將普伐他汀溶解、激活、滴定后加無菌蒸餾水配制成1 mmol/L備用。吉西他濱為市售齊魯制藥公司產品，溶解于無菌0.9%生理鹽水，按實驗設定用培養基稀釋成所需終濃度。胎牛血清為杭州四季青生物技術公司產品，四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司。試劑均為分析純。

1.2 細胞培養

在37℃、飽和濕度、5%CO2的培養箱內，將SW1990細胞于含10%胎牛血清、含青霉素100 U/mL、含鏈霉素100 U/mL的RPMI-1640培養基中常規傳代培養。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT比色法檢測普伐他汀對SW1990細胞增殖的影響 取對數生長期細胞，經胰酶消化后制備成單細胞懸液（濃度為1×105/mL），接種于96孔板培養，待細胞貼壁后，加入含不同濃度普伐他汀的RPMI-1640培養液，培養24、48、72 h收集細胞，上機測定OD值（代表細胞存活率）。實驗設空白對照組（培養基調零）、細胞對照組（未經普伐他汀處理）、含5、15、25 μmol/L普伐他汀的處理組，每組設6個平行孔，所有實驗重復3次。收集細胞前預先加入MTT液，培養4 h后于波長570 nm處測定OD值并計算細胞生長抑制率： 生長抑制率%=（細胞組OD值-處理組OD值）/（細胞組OD值-空白組OD值）×100%。

1.3.2 光學顯微鏡下細胞形態學變化 SW1990細胞接種于培養瓶中，貼壁后，加入0、5、15、25 μmol/L普伐他汀，繼續生長48 h，培養瓶置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態并隨機拍照。

1.3.3 流式細胞儀測定細胞凋亡率 將對數生長期細胞接種于培養瓶中，待細胞貼壁后，加入0、5、15、25 μmol/L的普伐他汀處理48h后收獲細胞，采用流式細胞儀對細胞進行DNA分析并計算凋亡率。

1.3.4 MTT比色法檢測普伐他汀聯合吉西他濱對SW1990細胞增殖的影響 將對數生長期的SW1990細胞接種于96孔板上，細胞貼壁后加入含不同組別、不同濃度藥物的培養基培養48 h，收集細胞后上機測定OD值并計算不同組別細胞生長抑制率。實驗設空白對照組、細胞對照組、濃度為0.1、0.5、2 μg/mL單藥吉西他濱組、濃度為5、15、25 μmol/L普伐他汀分別聯合0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱組。

通過iobolanalysis分析按公式CI值=普伐他汀1/普伐他汀2+吉西他濱1/吉西他濱2計算兩藥聯合的相互作用指數（combination index，CI）。其中，普伐他汀1、吉西他濱1為兩藥聯合達到某一生長抑制率時各自的濃度，普伐他汀2、吉西他濱2為兩藥單獨應用達到相同生長抑制率時的各自的濃度。CI值<1.0表明兩藥聯合具有協同作用；CI值=1.0表明兩藥聯合具有相加作用或無關作用；CI值>1.0表明兩藥聯合具有拮抗作用。

1.4統計學方法

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計學處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1普伐他汀對SW1990細胞增殖的影響

MTT法結果顯示，5、15、25 μmol/L普伐他汀處理細胞24～72 h后，各處理組OD值逐漸下降，呈現明顯的劑量和時間依賴性（表1）。方差分析結果顯示同一作用時間，各組OD值差異有統計學意義（24 h 組別：F=99.905，P<0.05；48 h 組別：F=274.000，P<0.05；72 h 組別：F=316.670，P<0.05）。

2.2 細胞形態學觀察

對照組細胞呈扁長形，形態規則、連接緊密。細胞經不同濃度普伐他汀處理48 h后，出現凋亡的形態學改變：細胞皺縮變形，有的胞質中可見中空的空泡，細胞破裂增多，在細胞周圍可見大量裂解片段，細胞之間空隙增加，見圖1。

圖1 不同濃度普伐他汀作用SW1990細胞48 h（10×10）

2.3普伐他汀對SW1990細胞凋亡的影響

如圖2所示：SW1990細胞經5、15、25 μmol/L普伐他汀處理48 h后，流式細胞儀測得的細胞凋亡率隨處理濃度增加逐漸升高。

2.4 普伐他汀聯合吉西他濱對SW1990細胞增殖的影響

MTT比色法分析了普伐他汀聯合吉西他濱對SW1990細胞增殖的作用，如表2所示，0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱作用細胞后，OD值顯著低于細胞對照組（F=851.059，P<0.05）。5、15、25 μmol/L普伐他汀分別配伍聯合0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱，不同濃度普伐他汀聯合某一濃度吉西他濱后，聯合組OD值顯著低于該濃度單藥吉西他濱組0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱組別（F值分別為93.543、124.774、14.060，P均<0.05）。

根據公式計算出普伐他汀聯合吉西他濱作用SW1990細胞后的生長抑制率并繪制成抑制率曲線（圖3）。從抑制率曲線中可以看出聯合5、15、25 μmol/L普伐他汀可顯著降低吉西他濱的IC50值，且隨著普伐他汀濃度增加，吉西他濱的IC50值降低愈明顯。根據CI值公式，我們計算了普伐他汀聯合吉西他濱達到細胞生長抑制率為50%時的CI值，發現普伐他汀聯合吉西他濱的CI值均<1，說明普伐他汀和吉西他濱可協同抑制SW1990細胞增殖。

3 討論

HMG-CoA還原酶是內源性膽固醇合成的限速酶。他汀類藥物包括辛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀等，通過競爭性抑制HMG-CoA還原酶的活性阻滯甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）通路，減少細胞內膽固醇的合成，并能增加血清膽固醇的清除，從而起到降低膽固醇的作用。膽固醇合成過程中的中間產物MVA是體內許多生物活性物質的前體，如泛醌、血紅素A、異戊烯腺嘌呤、焦磷酸法呢酯（FPP）、焦磷酸牻牛兒基牻牛兒酯（GGPP）等[5]。他汀類藥物可通過阻礙MVA途徑從而抑制其一系列下游產物的合成，進而影響細胞生長、分化、凋亡及細胞間信號傳導，發揮調控腫瘤生長和轉移的作用[6-8]。隨著分子生物學技術的發展和研究的不斷深入，他汀類藥物的抗腫瘤作用日益受到重視。近年來一系列的研究表明，他汀類藥物對前列腺癌[9]、肺癌[10]、乳腺癌[11，12]、結直腸癌[13]、惡性膠質瘤[14]、頭頸部腫瘤[15]等多種腫瘤細胞具有明確的抑制作用。

本實驗通過MTT法觀察普伐他汀對胰腺癌細胞SW1990的影響，發現普伐他汀可明顯抑制細胞生長。如表1所示，不同濃度普伐他汀作用SW1990細胞24～72 h后，抑制率由14.47%增至65.37%。光學顯微鏡下，我們可以看到普伐他汀作用細胞后的凋亡形態學改變，DNA凝膠電泳則顯示藥物組出現階梯狀排列的DAN梯帶，說明普伐他汀可誘導SW1990細胞發生凋亡。在聯合用藥的實驗中，經計算普伐他汀聯合吉西他濱的CI值均小于1，證實普伐他汀可增強吉西他濱的抑瘤作用，二者聯合具有協同作用。實驗結果提示，在臨床應用吉西他濱單藥或含有吉西他濱的聯合化療方案治療胰腺癌，同時加用普伐他汀，可能起到增加化療藥物敏感性、減少化療藥物劑量的作用，進而提高進展期或晚期胰腺癌患者的化療耐受性，改善生活質量，延長生存期。

近年來越來越多的體外實驗和動物實驗證實他汀類藥物具有抗腫瘤作用，但確切的分子機制尚未闡明。本實驗的結果為臨床治療胰腺癌提供了一些有益的借鑒，關于普伐他汀抗胰腺癌細胞及增敏吉西他濱的作用機制尚待進一步深入研究。

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（收稿日期：2016-04-27）