丹參對單側輸尿管結扎模型大鼠腎臟核因子-κB及氧化物酶體增殖物激活受體-γ表達的影響

鐘　丹　鄒亦平　延衛東　黃宇清　陳小麗　王　娟

(井岡山大學臨床醫學院，江西　吉安　343009)

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丹參對單側輸尿管結扎模型大鼠腎臟核因子-κB及氧化物酶體增殖物激活受體-γ表達的影響

鐘丹鄒亦平1延衛東黃宇清陳小麗1王娟

(井岡山大學臨床醫學院，江西吉安343009)

摘要〔〕目的探討丹參對單側輸尿管結扎(UUO)所致腎間質纖維的影響及可能機制。方法應用UUO建立腎間質纖維化大鼠模型，丹參干預組按劑量高低分為低劑量組，中劑量組，高劑量組，各組均從模型建立前48 h開始灌胃，于造模后第7天，留取梗阻側腎臟行HE、Masson染色，觀察腎組織病理結構變化，采用免疫組化方法檢測腎組織核因子(NF)-κB及氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ的表達，RT-PCR方法檢測NF-κB及PPAR-γ mRNA的表達。結果UUO模型組大鼠腎組織可見腎小管上皮細胞變性、間質炎性細胞浸潤、纖維組織增生等病理變化，丹參各劑量組與UUO模型組大鼠相比較均有不同程度的改善，其中以丹參高劑量組改善最為明顯。與空白組相比較，UUO 模型組中NF-κB表達明顯增高，PPAR-γ表達明顯降低。丹參高、中劑量組NF-κB表達水平明顯低于UUO 模型組，丹參高劑量組PPAR-γ表達增強，與UUO模型組相比較有顯著差異。結論丹參可通過抑制NF-κB的表達，增強PPAR-γ的表達，從而起到腎臟保護和抗腎間質纖維化的作用。

關鍵詞〔〕丹參；腎間質纖維化；核因子-κB；氧化物酶體增殖物激活受體-γ

1井岡山大學附屬醫院

第一作者：鐘丹(1974-)，男，副教授，副主任醫師，博士，主要從事腎臟疾病的臨床、教學和科研工作。

腎間質纖維化是各種慢性腎臟疾病發展至終末期腎衰竭的共同機制，傳統中醫理論認為瘀血是腎臟疾病發生發展過程中重要的病理因素，活血化瘀在慢性腎臟疾病的治療中占有重要地位。丹參在心腦血管系統及腎臟疾病中作用顯著。本研究觀察丹參對單側輸尿管結扎(UUO)大鼠模型腎組織核因子(NF)-κB及氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ表達的影響，以進一步闡明該藥抗腎間質纖維化的可能作用機制。

1材料與方法

1.1材料健康SD雄性大鼠，體質量(200±10)g，清潔級，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：0003467。飼以標準大鼠合成飼料，自由飲用大鼠專用無菌水。丹參水煎液由本課題組成員自行制備。吡格列酮購自杭州中美華東制藥有限公司，國藥準字H20050500。Trizol RNA提取試劑盒、Platinum Taq DNA Polymerase、ThermoScript RT-PCR System 試劑盒(Invitrogen公司)；兔抗鼠NF-κB、兩步法免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2分組造模及給藥120只大鼠隨機均分為：空白組、模型組，吡格列酮組，丹參高、中、低劑量組。采用UUO〔1〕造模方法，各組均于模型建立前48 h灌胃，丹參灌胃量分別按3、2、1 g·kg-1·d-1灌胃給藥，每日給藥一次。模型組以等量生理鹽水灌胃。吡格列酮組灌胃量為30 mg·kg-1·d-1。

1.3病理檢測以造模后第7天為觀察時點，處死各組大鼠，取新鮮腎組織，以10%中性甲醛固定后，分別行HE 染色及Masson 染色，光鏡下觀察腎小管間質的結構變化，同時進行腎間質慢性病變(包括腎小管萎縮和間質纖維化)評分：200倍光鏡下盲法隨機取互不重疊的10個視野，間質纖維化：無(0分)、<相應視野區域25%(1分)、相應視野25%～50%(2分)、>相應視野50%(3分)；腎小管萎縮：無(0分)、<相應視野區域25%(1分)、相應視野25%～50%(2分)、>相應視野50%(3分)。由兩個觀察者對每個樣本腎組織進行盲法評分，取平均值，代表各樣品的腎小管間質損傷程度。

1.4免疫組化檢測免疫組化染色采用SP法步驟：3 μm石蠟切片脫蠟，水化后以3%H2O2去離子水孵育，以阻斷內源性過氧化物酶，抗原熱修復，正常山羊血清封閉后，分別滴加一抗NF-κB、PPAR-γ孵育，再依次加入生物素標記的羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液孵育。應用DAB溶液顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復染，脫水，透明，封片。每次染色均以PBS代替一抗做陰性對照。在每張切片不包含腎小球和血管的間質區域隨機選取10個高倍鏡視野(×200)，用彩色病理圖文報告分析系統對所選取視野中免疫組化陽性信號進行圖像分析，計算每個視野中NF-κB、PPAR-γ各自陽性染色面積占總視野面積的百分比，并計算其均值。

1.5NF-κB mRNA、PPAR-γ mRNA的檢測采用RT-PCR技術：應用Trizol試劑盒提取腎組織總RNA，運用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，以β-actin為內對照，進行半定量逆轉錄聚合酶鏈反應。引物設計如下：NF-κB：上游引物5'-ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC-3'，下游引物5'-TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCT-3'，擴增片段長度1 872 bp。PPAR-γ：上游引物5'-TGACCACTCCCATTCCTTTG-3'，下游引物5'-TTTCCTGTCAAGATCGCCCT-3'，擴增片段長度250 bp。β-actin：上游引物5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC-3'，下游引物：5'-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG-3'，擴增片段長度為216 bp。均經測序鑒定證實。聚合酶鏈反應條件根據RT-PCR試劑盒推薦條件優化，每次PCR反應至少重復3次。PCR產物用含0.5 mg/L溴乙啶的1.5%瓊脂凝膠電泳分析。根據雙標準曲線法，以目的基因與β-actin基因mRNA水平比值作為目的基因mRNA的相對表達量，比值越大，說明目的基因的表達越少。

1.6統計學方法采用SPSS13.0統計軟件包進行單因素方差分析，方差不齊者改用秩和檢驗的Kruskal-Wallish方法。

2結果

2.1丹參對模型大鼠腎臟組織病理形態的影響HE、Masson 染色觀察：UUO 模型組出現腎間質炎細胞浸潤，纖維組織增生，伴有大部分腎小管上皮細胞顆粒、空泡變性，部分腎小管上皮細胞壞死脫落，可見腎小管灶狀萎縮，部分腎小管腔可見脫落壞死組織及細胞形成顆粒管型及細胞管型；吡格列酮組、丹參組病理變化較UUO模型組減輕，其中尤以丹參高劑量組減輕最明顯。腎間質病變積分顯示，與模型組(2.005±0.033)比較，空白組、吡格列酮組、丹參高、中、低劑量組積分均降低(0.288±0.13、1.573±0.115、1.456±0.127、1.780±0.083、1.833±0.143)；與吡格列酮組比較，丹參高劑量組降低差異顯著(P<0.05)。

2.2各組大鼠腎組織NF-κB及PPAR-γ的表達與空白組比較，模型組腎小管上皮細胞、腎間質細胞核NF-κB 強陽性表達，吡格列酮組及丹參各劑量組NF-κB 表達水平低于UUO 模型組(P<0.05)；與空白組相比較，模型組及各治療組PPAR-γ表達明顯降低(P<0.05)，與模型組比較，丹參高、中劑量組PPAR-γ表達增高，其中丹參高劑量組表達增高有統計學(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠腎組織NF-κB mRNA及PPAR-γ mRNA的表達與空白組比較，模型組NF-κB mRNA表達明顯增強(P<0.01)；各藥物治療組NF-κB mRNA的表達均較模型組降低，但組間差異不明顯。與空白組比較，模型組PPAR-γ mRNA明顯降低(P<0.05)，各藥物治療組PPAR-γ mRNA的表達均較模型組升高(P<0.05或P<0.01)，與吡格列酮組比較，丹參高劑量組PPAR-γ mRNA的表達升高明顯(P<0.05)。見表2。

組別陽性表達面積NF-κBPPAR-γ空白組0.48±0.230.32±0.10模型組2.68±0.232)0.27±0.181)吡格列酮組0.97±0.213)0.28±0.111)丹參高劑量組0.68±0.263)0.30±0.013)丹參中劑量組0.81±0.563)0.28±0.011)丹參低劑量組0.89±0.333)0.27±0.011)

與空白組比較：1)P<0.05;2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05

組別NF-κBPPAR-γ空白組1.29±0.221.25±0.16模型組1.13±0.331)1.62±0.121)吡格列酮組1.26±0.161.27±0.212)丹參高劑量組1.32±0.761.20±0.333)4)丹參中劑量組1.23±0.351.25±0.673)丹參低劑量組1.24±0.121.26±0.323)

與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05;3)P<0.01；與吡格列酮組比較：4)P<0.05

3討論

大量研究資料表明〔2,3〕，各種腎臟疾病在發生發展過程都會出現不同程度的炎癥細胞浸潤、腎小管萎縮、腎間質纖維化等一系列病理過程。腎間質纖維化的程度是決定腎臟疾病預后的最重要因素之一。UUO模型由于尿液排出受阻，腎盂及腎小管壓力增高，腎盂等集合管系統擴張，腎間質水腫，局灶性炎癥細胞浸潤，最終導致腎間質纖維化。

NF-κB在多種組織器官損傷中具有中心調控作用，可參與促進炎癥性細胞因子和趨化因子的產生、成纖維細胞的增生分化、ECM交聯及細胞凋亡等過程，并參與了腎組織損害過程，促進腎臟疾病的進展。因此在許多腎臟疾病發生發展過程中的作用不容忽視，特別是其致炎及致纖維化作用〔4〕。

PPARs是一類配體激活的核轉錄因子超家族成員之一。已經證實腎臟組織和細胞中表達PPARs，并且在慢性腎臟病進展過程中，PPAR-γ表達量呈下降趨勢。在UUO大鼠模型中，腎組織PPAR-γ表達增加，阿伐他汀可以顯著增加PPAR-γ表達，從而改善腎間質纖維化〔5,6〕。

中醫學〔7〕認為腎纖維化的形成主要由氣滯血瘀、痰濕交阻、經絡閉阻等相互影響而成，治療上主要以活血化瘀、攻毒泄濁散結為主。病程中腎臟病理學得改變、凝血機制的激活以及微血栓的形成均與中醫學所說“血瘀”理論相符。研究〔8〕表明活血化瘀藥物是臨床抗纖維化最常使用的一類藥物，而丹參在此類藥物中的使用頻率最高。

本研究結果表明：丹參在腎間質纖維化早期可以通過抑制NF-κB 的表達，上調PPAR-γ的表達，從而減輕腎小管間質的微觀病理損害，起到抗腎小管-間質纖維化的作用，而且這種作用具有劑量的依賴性，以丹參大劑量效果最為明顯。

參考文獻4

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5Kimura H,Li X,Torii K,etal.A natural PPAR-γ agonist 15-deoxy-delta 12,14-prostaglandin J2 may act as an enhancer of PAI-1 in human proximal renal tubular cells under hypoxic and inflammatory conditions〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2008；23(4):2496-503.

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7沈慶法.中醫臨床腎臟病學〔M〕.上海：上海中醫藥大學出版社，2007:63.

8賈秀琴，李雪梅.中藥抗腎纖維化用藥規律探析〔J〕.中國中西醫結合腎病雜志,2006；12(7):739-40.

〔2014-12-09修回〕

(編輯曹夢園)

基金項目：江西省教育廳科學技術研究項目(No.GJJ12479)

中圖分類號〔〕R285.5〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7003-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.016