JAK2 V617F基因突變與腦梗死的相關性

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JAK2 V617F基因突變與腦梗死的相關性

周水陽胡喜梅趙迎春1包維鶯李旗1柯金陸翠范燕琴朱銳鋒王恒石劉媛張文慧

(上海市松江區中心醫院血液科,上海201600)

關鍵詞〔〕腦梗死；JAK2V617F突變；等位基因特異性聚合酶鏈反應(AS-PCR)

1上海市松江區中心醫院神經內科

第一作者：周水陽(1971-)，男，副主任醫師，主要從事血液腫瘤研究。

腦梗死占急性腦梗死的 20%～30%〔1,2〕。JAK2 V617F 基因突變為體細胞獲得性單核苷酸突變，是由 JAK2 基因1 849 位鳥嘌呤(G)突變為胸腺嘧啶(T)，使 JAK2 蛋白 617 位纈氨酸錯義編碼為苯丙氨酸，導致 JH2 區的空間結構發生變化，使其對JH1區的抑制作用消失、JAK2激酶的活性增加〔3〕。JAK2 V617F 基因突變可出現在非典型慢性粒細胞性白血病、慢性粒單細胞性白血病、慢性中性粒細胞性白血病、特發性嗜酸細胞增多癥、骨髓增生異常綜合征(MDS)中〔4,5〕，本研究旨在了解JAK2 V617F基因突變與腦梗死相關性。

1資料與方法

1.1一般資料2012年1月至2013年1月我院神經內科收治的影像學(CT)或磁共振成像(MRI)明確的腦卒中和腔隙性腦梗死患者60例不合并常見腦梗死患者的外周血，即患者均不合并高血壓、糖尿病、腫瘤、免疫系統疾病且不伴有血小板、血紅蛋白升高。男36例，女24例，年齡47～71周歲。30例我院健康體檢健康者的外周血為健康對照。男17例，女13例，年齡47～71周歲。

1.2基因組DNA提取采集患者外周血2 ml，用Invitek DNA試劑盒提取基因組DNA，用分光光度計(型號PICO17)檢測濃度并確定純度后，DNA終濃度調整為50 ng/μl。

1.3JAK2/V617F 突變檢測采用等位基因特異性 PCR(AS-PCR)方法檢測 JAK2 基因第 12 號外顯子(1 849位 G→T 突變)，以包含 JAK2 基因 V617 密碼子位點設計引物，引物由 Invitrogen 公司合成。引物序列如下：P1:5′-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3′；P2:5′-ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAAG-3′；P3:5′-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGT-TTCA-3′。P1 和P2 擴增長度為203 bp,為陽性序列；P2和P3擴增產物長度為364 bp,為參考序列。反應總體系25 μl：50 ng/μl模板 DNA 1 μl，10 pmol/μl引物各0.5 μl,10×HS Taq緩沖液2.5 μl，dNTPs(每種堿基終濃度2.5 mmol/L)2 μl,HS Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.2 μl(Takara公司產品)，去離子水17.3 μl。反應條件為 94℃預變性 5 min；94℃ 變性30 s，52℃復性30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；72℃延伸5 min；4℃保存。

1.4基因測序選取其中 20 例標本送 Invitrogen 公司進行測序，測序結果與 NCBI人類基因組資料庫進行對比，出現 G→T 突變者為陽性。

1.5統計學處理采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗和Kaplan-Meier 法回歸分析。

2結果

2.1JAK2 V617F點突變60 例腦梗死的患者經 AS-PCR 檢測到JAK2 V617F 點突變16例(26.7%)。圖1為PCR擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳圖，JAK2 V617F 點突變陰性為364 bp一條帶，JAK2 V617F 點突變陽性為203、364 bp兩條帶。而健康對照者只有364 bp一條條帶。將瓊脂糖凝膠電泳存在雙條帶的PCR擴增產物進行回收、純化和測序。測序結果與NCBⅠ人類基因庫對比，證實存在DNA突變，突變點位于JAK第12號外顯子，編碼V617的第一個堿基G被T替換，氨基酸由V變成F，即V617F。隨機取瓊脂糖凝膠電泳只有單條帶的PCR擴增產物基因測序，均無突變。

2.2JAK2 V617F 突變型患者外周血細胞數分析由表1可看出這些 JAK2 V617F 突變型患者并不伴有血小板、血紅細胞的升高。

M：Marker；1：陽性對照(HEL細胞系)；2：JAK2 V617F突變型患者；3：健康對照者圖1　PCR擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳圖

JAK2突變n血小板(×109/L)血紅蛋白(g/L)陰性44203.1±43.20169.25±13.25陽性16210.3±55.41161.44±20.10P值0.110.14

3討論

James 等〔3〕率先報道在真紅細胞增多癥中發現了JAK2 基因突變(V617F)，隨著研究的深入，許多學者相信對 JAK2V617F 的研究意義重大〔6，7〕。JAK2 蛋白分子是許多細胞因子在細胞膜內信號傳導的亞單位，其不但接受受體配體結合產生的信號，而且通過與細胞質內更多蛋白質分子的相互作用，改變它們的磷酸化狀態，以傳遞或放大信號。最常見的蛋白質分子是信號傳導和轉錄活化亞單位(STATS)，活化的 JAK2 分子使 STATS 磷酸化而發生構型改變，產生二聚體轉入細胞核內，改變靶基因的表達，因此，JAK-STAT 通路在細胞的增殖與抗凋亡過程中發揮著重要的作用。但是在上述配體、受體和 JAK2 聚集成異多聚體的過程中，任何一步的異常和畸變都足以消除激酶的活性，以致完全破壞整個信號通路，使細胞失去對細胞因子的正常反應性,從而引發疾病的發生〔8〕。

由本研究結果推測 JAK2 V617F 突變在不合并腦梗死有一定的高突變率，這為腦梗死發病機制探討提供了一定的參考價值，因此可作為腦梗死的易患因素加以考慮預防。

參考文獻4

1趙高年,劉穎,王榮富.銀杏酮酯分散片治療急性腦梗死的臨床療效〔J〕.江蘇醫藥雜志，2012;38(19)：2334-5.

2王平,謝錫駒,王鋒.40例青年腦梗死臨床特征分析〔J〕.江蘇醫藥雜志,2013;39(4):465-6.

3James C,Ugo V,Couedic JPL,etal.A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signaling causes poly cythaemia vera〔J〕.Nature,2005;434(7037):1144-8.

4Baxter EJ,Scott LM,Campbell PJ,etal.Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myelopmliferative diseases〔J〕.Lancet,2005;365(9464):1054-61.

5Kralovics R,Passamonti F,Buser AS,etal.A gain-of-function mutation of JAK2 in myelopmliferative disorders〔J〕.N Engl J Med,2005;352:1779-90.

6Dupont S，Masse A,James C,etal.The JAK2 617VF mutation triggers erythropoietin hypersensitivity and terminal erythroid amplification in primary cells from patients with polycythemia vera〔J〕.Blood，2007;110：1013-21.

7Wolankkyj AP,Lasho TL,Schwager SM,etal.JAK2 mutaion in essential thrombocythaemia:clinical associations and long-term prognostic relevance〔J〕.Br J Haematol,2005;131(2):208-13.

8沈益民,晁紅穎,張日,等.80 例急性髓性白血病 M2 型患者 JAK2V617F 基因突變的檢測及臨床意義〔J〕.中華腫瘤雜志，2009;31(5):366-70.

〔2014-05-17修回〕

(編輯杜娟)

基金項目：上海市松江區科學技術攻關項目(QK1107)

中圖分類號〔〕R4〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7221-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.121