生物膜法應用于濕地恢復監測的適用性研究

摘要：生物膜法是理想的群落水平水生態監測的方法，能夠全面反映濕地恢復前后生態健康水平，生物膜法具有重要的研究意義和應用前景。以四川省邛海濕地五期恢復工程為研究對象，綜合運用原位生物膜法、群落分析法和生理生態學方法，通過比較五期濕地恢復工程建設前、建設期和恢復期的生物膜結構和功能指標的變化，分析生物膜對濕地恢復工程不同時期的響應情況。結果表明，濕地恢復工程施工對生物膜的結構和功能產生顯著影響，其中對藻類結構和細菌胞外酶活性影響最大?；谒治龅母黜椫笜?，天然基質生物膜對濕地恢復具有很好的響應，生物膜法適用于濕地恢復的生態監測，可進一步建立評價方法并推廣應用。

關鍵詞：生物膜；濕地恢復；生態監測

中圖分類號： Q948；X17文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0506-05

濕地是界于水域和陸地之間的具有一定生態功能的交錯地帶[1]。它在為人類提供生產、生活等各種資源的同時也發揮著調節徑流、降解污染、調節氣候等環境生態作用，被譽為“地球之腎”。然而，隨著人類社會的不斷發展及氣候變化等自然因素，濕地面臨著不斷退化的威脅。因此，為緩解濕地與人類發展需求之間的矛盾，人工恢復濕地逐步成為濕地保護和利用的重要補償性辦法，并引起社會各界人士的廣泛關注[2]。而對濕地恢復過程的跟蹤監測對于科學恢復濕地、管理濕地以及客觀評價濕地恢復效果等工作具有重要意義[3]。

濕地恢復監測的方法和指標，主要集中于對濕地水文、水環境、濕地土壤、氣象及濕地生物的監測[3-5]，而常用的濕地恢復效果評價方法包括能值分析法、濕地生態系統健康評價法以及景觀格局分析法[6-7]。但通過對濕地的植被、水鳥等動植物的生物監測發現，因生境破碎化嚴重、水生生物大量滅絕、調水等問題為生物監測帶來困難，傳統的生物監測已不能滿足其生態監測的需求[8]。而生物膜普遍存在于各種基質的表面上[9]，代表了一種穩定微生物細胞組成的復雜混合物的微生態系統，對水質、水量、土地利用類型等環境壓力會產生響應[10-11]，因而生物膜法是理想的群落水平水生態監測的方法[12]。

邛海位于四川省涼山彝族自治州西昌市東南面，距城區僅4.5 km，是非常特殊的城郊型濕地。本次選取對原農田濕地進行了全方位改造的五期濕地恢復工程為研究對象，通過分析生物膜結構和功能指標的變化，來研究生物膜對濕地恢復工程不同時期的響應情況，以期為生物膜監測應用于濕地恢復評價中提供依據。

1材料與方法

1.1研究區概況

邛海位于四川省西昌市，流域面積307.67 km2，系四川省第二大淡水湖泊。20世紀中后期以來，填海造田、圍海造塘、泥沙淤積、氣候變暖等各種人為、自然因素使邛海的蓄水面積由31 km2減少至27 km2，邛海的濕地生態功能受到嚴重破壞，水質惡化嚴重。為了控制濕地的不斷退化，充分發揮濕地的生態環境功能，從2009年開始，西昌啟動總面積約為 1 333 km2，依據各自特色分六期規劃完成的邛海生態保護與濕地恢復工程建設。本次研究點“夢回田園”五期濕地于2014年5月正式開工建設，2014年12月22日竣工開園，建有5個以“河”為主題的自然生態區域，該期濕地通過恢復臨水天然濕地，改造和保留農用土地來達到其目的。

1.2生物膜的采集

本研究分別于2014年4月（建設前）、6月、8月、10月、12月（建設期）及2015年4月（恢復期）在邛海五期濕地恢復區（S1）進行樣品采集，并選取已完工5年的邛海一期濕地（S2）作為參照點。各濕地沿湖岸設3個采樣點，每個采樣點隨機選取2處間隔50 m以上的石頭進行采樣，所采集的生物膜用0.2 μm濾膜過濾后的樣點水懸浮，一份加入5%甲醛固定，用于藻組成識別分析；所有樣品用冰盒保存帶回實驗室用于分析其生物量、酶活性指標的變化。

1.3生物膜各指標的分析

生物膜各指標分析方法參照前期相關研究中的方法[8，13]，實驗室測定生物膜的葉綠素含量（葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c）、無灰干質量（AFDM）、藻類組成、磷酸酶（APA）活性、胞外聚合物多糖（PSC）含量。

1.4水樣采集與理化指標測定

同步采集水樣，保存以及測定參照《水和廢水監測分析方法（第4版）》，現場測定pH值、溫度（T）、透明度（Trans）、溶解氧（DO），實驗室測定氨氮（NH3-N）、總氮（TN）、總磷（TP）、化學需氧量（COD）、高錳酸鹽指數（CODMn）、生化需氧量（BOD5）、氟化物（F-）等指標，并使用葉綠素a、TN、TP、Trans、CODMn等5項指標計算綜合營養指數（TSI）。

2結果與分析

2.1生物量

對邛海五期濕地恢復區（S1）不同時期的生物膜葉綠素a進行比較（圖1），可見建設期和恢復期的葉綠素a濃度顯著低于建設前。參照對照點邛海一期濕地（S2）進行分析，恢復工程開始后（6—8月）邛海五期濕地恢復區（S1）的生物膜葉綠素a濃度顯著下降，而同時段的參照點受季節影響葉綠素濃度有顯著的升高（P<0.05），說明恢復工程的建設顯著影響了藻類的生長。在建設期中葉綠素a濃度在10月較8月有所回升，該時段工程破壞較小并開始植被恢復，因而藻類生長脅迫壓力減小?；謴推谳^建設前同時段（4月）的葉綠素a濃度顯著降低，反映了濕地恢復后環境發生了改變。綜上說明生物膜葉綠素a濃度受濕地工程建設影響，工程建設導致原有植被等被破壞，葉綠素a濃度顯著降低，濕地植被恢復后葉綠素a濃度有所升高。

由圖2可見，濕地恢復區生物膜的無灰干質量（AFDW）與參照點在建設前、建設期的變化規律相似，但對應葉綠素a濃度在6月、8月減少，說明此段時間內無灰干質量主要積累為無機物，可能受工程建設水土流失的影響所致?；謴推诘臒o灰干質量與建設后期（10月、12月）差異不顯著（P>005），并顯著低于建設前，說明工程建設影響仍然存在，生物膜群落尚未完全恢復。

天然生物膜經過長期的培養和演替，具有更加成熟的結構組成和更大的生物量，有研究表明自養指數可以反映水體污染程度[14]，因此計算生物膜群落的自養指數進行比較公式（1）。

式中：AI為自養指數；AFDM為無灰干質量；chla為葉綠素a濃度。

由圖3可見，生物膜的自養指數在建設期初（6月）較建設前顯著增加（P<0.05），但同時期參照點無顯著差異（P<

0.05），表明建設工程的開始對水環境造成較大的污染。但建設期中10月出現了顯著下降（P<0.05），同時期參照點卻有所上升，說明10月工程措施的停止和植被的恢復對水環境有較大影響。綜上可見自養指數對于濕地工程不同建設時期有明顯的響應。

2.2藻類結構

由圖4可見，其中濕地恢復區（S1）不同時期的硅藻比例差異顯著（P<0.05），其中建設期較建設前的硅藻比例出現極顯著下降（P<0.01），而綠藻比例在建設開始初期出現了顯著升高（P<0.05），而同時期參照點邛海公園生物中的綠藻比例變化不顯著（P<0.05），這說明生物膜藻類結構的變化明顯受到濕地建設工程的影響，其中硅藻、綠藻對建設工程的響應最明顯?；謴推诘纳锬ぴ孱愐怨柙鍨橹?，較建設前和建設期的硅藻比例都有所升高，說明該時期的水環境情況較好。

色素比例可以一定程度上反映藻類組成，且測定方法簡單，節約時間[15]，由圖5可見葉綠素b濃度變化規律與參照點相似，說明受濕地恢復工程影響較小。而葉綠素c濃度在建設期波動較大，且恢復期顯著高于建設前，這樣藻類結構中硅藻的變化規律一致。說明了硅藻、葉綠素c濃度對濕地恢復工程的響應最顯著。

2.3胞外聚合物多糖含量

胞外聚合物（EPS）的多糖（PSC）含量的測定結果（圖6）表明，濕地恢復區（S1）建設期6—8月較建設前多糖含量顯著增加，但同時期參照點增加極顯著（P<0.01），說明生物膜微生物分泌形成胞外聚合物的過程可能受到了建設工程的影響；建設期12月較建設期10月多糖含量下降達最低值，為0.114±0.229 mg/cm2，但同時期參照點含量增加；恢復期核多糖含量較建設期顯著增加（P<0.05），說明多糖含量受濕地工程建設的影響，其中建造后期和恢復期影響較大。

2.4磷酸酶活性

由圖7可見，磷酸酶活性受濕地恢復工程的影響也較大。濕地恢復區（S1）的生物膜磷酸酶活性在建設期呈逐步下降趨勢，并在恢復期較前面的時期出現顯著升高（P<0.05），而同時期的參照點受季節影響呈先升高后下降的趨勢。說明生物膜胞外酶活性受工程建設影響下降，但在恢復期得到升高，微生物生長恢復。

2.5水質因子測定結果

根據同期水質監測數據（表1）可以看出，邛海濕地的水質狀況較好，全年月平均水質均達到國家地表水Ⅰ類水質標準。其中受濕地恢復工程的影響，在2014年6月、8月的水體透明度（Trans）較低，且8月有機物污染較其他月份嚴重，COD、BOD5的最大值分別為15.33 mg/L和3.05 mg/L，均超過國家地表水Ⅱ類水質標準。濕地恢復后的2015年4月較恢復前水質狀況更佳，水體綜合營養指數有所下降。

3討論

3.1生物膜群落對濕地恢復工程的響應

生物膜可以對各種形式的干擾產生響應，在野外環境中，生物膜會受到水文、氣候、捕食壓力、水質狀況等各種干擾的影響。而濕地恢復工程在建設期會對植被造成破壞，產生大量水土流失并對水體產生污染，在恢復期逐步構建新的生態景觀，這些因素都構成了對生物膜群落的干擾。

生物膜的生物量指標可以反映出生物因子、環境因子對群落的影響[13]。本研究中生物膜葉綠素a濃度、無灰干質量在建設期均發生了改變。葉綠素a濃度在建設開始后出現顯著下降，可能是由于施工中挖掘對水體的擾動及水土流失造成水體渾濁影響了藻類的生長。而恢復期的葉綠素濃度較建設前低，可能是由于濕地恢復改變了土地利用類型造成的影響，Findlay等對新西蘭河流的研究結果表明土地利用類型會對生物膜群落產生定性和定量的影響[16]。建設前該區域主要為農田濕地，農業生產使用大量化肥，會使營養物質顯著增加，進而促進生物膜生物量的生長，故生物量較恢復后高。

從結構指標上來看，生物膜藻類結構的變化明顯受到濕地建設工程的影響，其中硅藻、綠藻對建設工程的響應最明顯。建設期較建設前的硅藻比例出現極顯著下降（P<0.01），而綠藻比例在建設開始初期出現了顯著升高（P<0.05），而恢復期的生物膜藻類以硅藻為主，較建設前和建設期的硅藻比例都有所升高。其原因主要可能是濕地恢復工程影響了水體的透明度，進而影響光照程度，生物膜在光照充分的情況下比較高，硅藻數目多。此外光照不僅會對生物膜組成結構產生直接的影響，還會通過影響其他環境因子進而使得生物膜群落發生改變[17]。另一方面濕地恢復工程還會對水體的營養水平產生影響，進而影響藻類的生長，與其他藻類相比綠藻更適宜在中等營養狀態下生長，在高營養條件下綠藻生長受到藍藻的抑制，而隨著氮磷和有機污染物大量降低，不能滿足大多數綠藻的生長條件，因此綠藻比例在建設期中先升高后降低。不同的藻類含有不同的色素種類，其中，藍藻門只含葉綠素a，不含葉綠素b、葉綠素c；綠藻門含葉綠素a和葉綠素b；硅藻門、甲藻門、金藻門均含葉綠素a和葉綠素c[15]，因而葉綠素b、葉綠素c從色素水平上也反應出了相同的藻類結構變化。

胞外聚合物多糖含量和磷酸酶活性都與生物膜的細菌群落有密切關系。生物膜的微生物會分泌形成復雜的胞外聚合物（EPS），其中多糖占生物膜有機成分的50%～90%，因此多糖被認為是胞外聚合物的標志性成分。磷酸酶活性被認為可以反映相應環境中微生物可能進行的聚合物的降級和代謝[8]。因此本研究中胞外聚合物多糖含量和磷酸酶活性變化，反映了由于濕地恢復而引起的細菌群落的變化。

綜上可見，生物膜群落可對濕地恢復工程的主要干擾產生不同程度的響應，進而可利用生物膜對濕地恢復工程進行監測評價。

3.2生物膜群落對水質因子的響應

由于邛海水體以營養元素和耗氧有機污染為主，因此選取包括pH值、T、Trans、COD、NH4-N、BOD5、DO、F-和TSI共9個水質因子進行RDA分析，以確定生物膜群落特征與各水質因子的關系。由表2可見，水質因子對生物膜群落具有顯著影響（P<0.05）。RDA分析的前2個排序軸特征值分別為0.407和0.344，共解釋了75.1%的生物膜群落特征變化。

從圖8可見，對于第1排序軸（Axis1），水質因子中COD、BOD5與生物膜群落呈正相關，而pH、NH4-N、TSI與Axis1呈負相關，這些水質因子都與營養狀況有關，說明該特征軸反映邛海濕地的水質營養污染狀況。其中葉綠素a、藍藻比例（CYA）受pH、NH4-N、TSI的影響較大，磷酸酶活性（APA）、多糖含量（PSC）、葉綠素b、葉綠素c受有機物污染影響較大。葉綠素a、藻類組成在研究生物膜群落對水質的響應中被廣泛使用，在本研究中，葉綠素a濃度與水體營養指標呈正相關關系，硅藻比例與水體營養指標呈負相關關系，這與許多相關研究結果相同。第2排序軸（Axis2）與T、pH呈正相關，與Trans、DO、F-呈負相關，該特征軸主要反映邛海濕地的物理因子。在高透明度（Trans）的條件下硅藻比例（BAC）、其他藻類比例（Others）和葉綠素c/葉綠素a會相對較高，而綠藻比例（CHL）、AFDW和AI與受溫度影響顯著。其中溶解氧（DO）與生物膜群落特征的相關性較弱。生物膜群落可以對各種污染物質產生響應，而在天然水體中加上有光照、溫度、水力條件等因素的影響，使得生物膜群落的響應并不遵從單因子情況時的規律，且與多種環境因素相關。在本研究中選定的水質因子可以解釋生物膜群落變化的75.1%，說明生物膜群落能夠很好地響應水質因子的變化。

4結論

生物膜的結構和功能指標受濕地恢復工程的影響產生變化，其中葉綠素a濃度、硅藻比例和磷酸酶活性受建設影響出現顯著降低，其他指標也有不同程度變化，可見濕地恢復工程對藻類結構和細菌胞外酶活性影響最大，生物膜群落對于濕地恢復具有很好地響應。RDA分析生物膜群落特征各指標與水質指標顯著相關（P<0.05），生物膜群落能夠很好地響應水質因子的變化。綜上可見生物膜是濕地監測評價的適宜工具，可進一步篩選指標建立評價體系，應用到濕地恢復的監測評價中。本研究僅對區域濕地恢復工程進行了短期監測分析，邛海濕地恢復工程巨大，目前六期工程已基本全部完工，可為其分階段長期通過生物膜法評價恢復效果提供依據。

參考文獻：

[1]崔麗娟，張曼胤，張巖，等. 濕地恢復研究現狀及前瞻[J]. 世界林業研究，2011，30（2）：226-236.

[2]王明春，楊月偉. 黃河三角洲濕地恢復對濕地鳥類群落的效應研究[D]. 曲阜：曲阜師范大學，2010.

[3]崔麗娟，張曼胤，趙欣勝，等. 濕地恢復監測與管理方法探討[J]. 世界林業研究，2011，24（3）：1-5.

[4]黃翀，劉高煥，傅新，等. 黃河三角洲刁口河流路濕地恢復遙感監測與評價[J]. 地理科學進展，2012，31（5）：570-576.

[5]毋兆鵬，金海龍，王范霞. 艾比湖退化濕地的生態恢復[J]. 水土保持學報，2012，26（3）：211-215.

[6]王慧亮，王學雷，莫明浩，等. 基于生態健康的洪湖濕地恢復評價[J]. 武漢大學學報：理學版，2010（5）：557-563.

[7]婧祎，趙文武. 生態恢復評價研究進展與展望：第5屆國際生態恢復學會大會會議述評[J]. 中國應用生態學報，2014，25（9）：2716-2722.

[8]王雪梅，劉靜玲，馬牧源. 生物膜法應用于白洋淀濕地生態監測的基質篩選研究[J]. 農業環境科學學報，2010，29（10）：1876-1883.

[9]Nocker A，Lepo J E，Martin L L，et al. Response of estuarine biofilm microbial community development to changes in dissolved oxygen and nutrient concentrations[J]. Microbial Ecology，2007，54（3）：532-542.[ZK）]

[10]Ma M Y，Liu J L，Wang X M. Biofilms as potential indicators of macrophyte-dominated lake health[J]. Ecotoxicology，2011，20（5）：982-992.

[11]馬牧源，劉靜玲，楊志峰. 生物膜法應用于海河流域濕地生態系統健康評價展望[J]. 環境科學學報，2010，30（2）：226-236.

[12]Sabater S，Guasch H，Ricart M，et al. Monitoring the effect of chemicals on biological communities. The biofilm as an interface[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，387（4）：1425-1434.

[13]王雪梅. 白洋淀流域復合污染的生物膜監測方法適用性分析[J]. 農業環境科學學報，2014，33（9）：1802-1809.

[14]Bonet B，Corcoll N，Acuňa V，et al. Seasonal changes in antioxidant enzyme activities of freshwater biofilms in a metal polluted Mediterranean stream[J]. Science of the Total Environment，2013，444：60-72.

[15]曹治國，徐杰，劉靜玲，等. 淡水湖泊營養狀態監測新方法——葉綠素比值模型[J]. 環境科學學報，2010，30（2）：275-80.

[16]Findlay S，Sinsabaugh R L. Large-scale variation in subsurface stream biofilms：a cross-regional comparison of metabolic function and community similarity[J]. Microbial Ecology，2006，52（3）：491-500.

[17]馬牧源. 白洋淀流域生物膜群落對人為干擾的響應[D]. 北京：北京師范大學，2011.