環境條件對Bacillus altitudinis LZP02生物膜形成的影響

黃東慧，鐘 鵬，王建麗，胡云龍，王志剛，*

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農業微生物制劑產業化技術創新中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省農業科學院 畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；4.黑龍江省農業科學院 草業研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)

細菌生物膜是指細菌通過分泌胞外聚合物形成高度組織化、系統化的膜狀結構，是細菌為適應外界環境有利于存活的一種生命活動現象，其基質由胞外多糖和蛋白質組成，有助于黏附在根系表面。細菌生物膜形成主要分為黏附、積累、成熟、分散4個階段。細菌可以借助生物膜增強自身對環境中多種脅迫的抵抗能力，對于病原菌來說，生物膜形成可以增強其對抗生素的耐受性和宿主免疫系統攻擊抵抗能力。

細菌生物膜形成能力取決于營養(如二價陽離子)和環境條件(溫度、pH值、鹽脅迫)。較高濃度的Na或K顯著抑制了BF-17生物膜的形成，同時，Ca和Mn在低濃度時促進了其生物膜的形成，但在高濃度時表現出抑制作用。在不同溫度和pH值條件下，不同細菌的生物膜形成能力也不同。在對的研究中發現，ser.和的生物膜形成最適溫度分別為34.5 ℃和13.0 ℃。在32 ℃、pH值7.0時MS1生物膜形成能力最強，同時，Ca、Fe、K、Na促進其生物膜的形成，Cu、Mn抑制其生物膜的形成。

植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)具有促進植物生長和拮抗土傳病原菌的能力，其生物膜的形成可以保護植物根際免受土傳病菌的影響，促進植物生長。LZP02是一株從水稻根際分離出的有益菌，能夠定殖于根際，形成生物膜從而促進水稻生長。LZP02定殖于水稻根際時，會面臨復雜的土壤環境，如溫度、pH值、金屬離子等。因此，本研究主要研究環境條件對LZP02生物膜形成的影響，為進一步闡明LZP02對水稻的促生機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

LZP02菌株為本實驗室分離保存菌株。

LB培養基(1 000 mL)：蛋白胨10.0 g，NaCl 8.0 g，酵母膏5.0 g，pH值7.0(固體培養基加瓊脂20.0 g)。

LBGM培養基(1 000 mL)：蛋白胨10.0 g，NaCl 8.0 g，酵母膏5.0 g，MnSO0.1 mmol·L，1%甘油，pH值7.0。

離子試劑：NaCl、KCl、Fe(SO)、FeSO、CaCO、MnSO、MgSO、CuSO、ZnSO

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與培養

取-80 ℃保存的LZP02菌種在LB固體培養基上劃線，置于30 ℃培養24 h。將平板中的單菌落挑出，移入100 mL LB液體培養基中，30 ℃、120 r·min振蕩培養12 h。

1.2.2 菌落形態與生物膜形成觀察

在4×電子顯微鏡下觀察LZP02在LB固體培養基上培養3 d的菌落形態。移取1mL培養至=1.0的新鮮菌液，8 000×離心5 min，棄上清，用等體積LBGM培養基洗滌2次并重懸于等體積的LBGM培養基。采用96孔細胞培養板，每孔加200 μL液體，實驗組為190 μ LLBGM培養基加10 μL上述菌懸液，對照組加入200 μL LBGM培養基，每個樣品做3個重復。在四周培養孔加入無菌水作為保護層。置于30 ℃培養，觀察成膜情況。

1.2.3 生物膜形成定量分析

首先緩慢移除孔板中的培養液，然后用無菌水清洗2～3次，洗去未黏附的菌體，室溫干燥后加入體積質量0.1%的結晶紫染液染色20 min，再用無菌水沖洗5次，室溫靜置干燥，除去多余水分，隨后加入丙酮-乙醇溶液(體積比80∶20)脫色15 min，混勻。最后用酶標儀測定在540 nm的吸光度，衡量生物膜的多少。

1.2.4 定殖分析

水稻種子用30% HO消毒30 min后，置于植物培養箱中，培養條件：光周期16 h/8 h(L/D)，溫度28 ℃/18 ℃，相對濕度60%～70%。每3 d用無菌水澆灌1次，直至苗期。將培養至=1.0的LZP02培養液倒入無菌空平皿中。取長勢一致的水稻幼苗，用無菌水沖洗其根部，然后將幼苗放入LZP02培養液中孵育1 h。將處理過的水稻幼苗轉移到無菌MS液體培養基中，置于植物培養箱中培養，在第2天取長為1 cm的根系，分別在體積分數50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇中脫水固定30 min。使用導電黏合劑將處理過的根黏附到樣品臺上，通過掃描電子顯微鏡觀察菌株在水稻根際的定殖。

1.2.5 環境因素對LZP02生物膜形成的影響

溫度：菌株按1.2.2節方法處理并分別置于25、30、35、40 ℃培養箱中培養48 h，每個處理3個重復，按1.2.3節方法檢測所形成生物膜的。

pH值：將LBGM培養基pH值調至3、4、5、6、7、8、9、10，按1.2.2節方法處理并置于培養箱中培養48 h，每個處理3個重復，按1.2.3節方法檢測所形成生物膜的。

金屬離子：在LBGM培養基中分別加入NaCl、KCl、Fe(SO)、FeSO、CaCO、MnSO、MgSO、CuSO、ZnSO。其中，Ca濃度設置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，Fe濃度設置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，Fe濃度設置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，Mg濃度設置為0、1、2、3、4 mmol·L，K濃度設置為0、30、60、90、120、150 mmol·L，Na濃度設置為0、85、170、255、340 mmol·L，Mn濃度設置為0、1、2、3、4 mmol·L，Zn濃度設置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，Cu濃度設置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L。按1.2.2節方法處理并置于培養箱中靜置培養48 h，每個處理做5個重復。按1.2.3節方法檢測所形成生物膜。

1.3 數據分析

采用SPSS 22.0(IBM，Armonk，New York，USA)進行數據分析，使用Dunnett檢驗確定數值差異，<0.05表示具有統計學意義。用GraphPad Prism 6軟件對相關數據作圖。

2 結果與分析

2.1 B. altitudinis LZP02生物膜的形成與根際定殖

在液-氣和固-氣表面可以觀察到LZP02的生物膜結構。圖1-A為LZP02在LBGM液體培養基表面逐漸形成生物膜，再慢慢分散的過程，培養24 h后，在液體表面開始觀察到生物膜形成，此為生物膜形成的第一階段，細菌黏附于液體表面。隨后在36～72 h進入第二階段，細菌逐漸形成緊密的生物膜結構。在84～96 h進入第三階段，出現復雜的生物膜結構。在108 h后進入第四階段，生物膜結構逐漸裂解。LZP02的菌落形態具有不同延展性的凸起褶皺結構(圖1-B)，可以在水稻幼苗根際穩定定殖(圖1-C)。

A，B. altitudinis LZP02生物膜形成的過程；B，B. altitudinis LZP02菌落形態；C，B. altitudinis LZP02定殖于水稻根際掃描電鏡圖。

2.2 溫度和pH值對B. altitudinis LZP02生物膜形成的影響

溫度對LZP02生物膜形成的影響如圖2-A所示。由圖2-A可以看出，LZP02在25 ℃生物膜形成能力弱，其他溫度下均能形成生物膜。由圖2-B可以看出，在30 ℃，LZP02生物膜形成能力最強。由圖2-A和2-C可以看出，LZP02能夠在pH值為4～10時形成生物膜，pH值為3時沒有觀察到生物膜形成。由圖2-C可以看出，在pH值為7.0時，LZP02的生物膜形成能力最強。因此，在LBGM培養基中，LZP02生物膜形成最適溫度為30 ℃，最適pH值為7.0。

柱上無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3 金屬離子對LZP02生物膜形成的影響

由圖3看出，金屬離子對LZP02生物膜形成有顯著影響。由圖4看出，0.5～1.5 mmol·LCa對LZP02生物膜形成沒有影響，而2.0 mmol·LCa對LZP02生物膜形成有抑制作用。

圖3 金屬離子對B. altitudinis LZP02生物膜形成的影響

圖4 金屬離子對B. altitudinis LZP02生物膜形成的影響

0.5～2.0 mmol·LFe、0.5～2.0 mmol·LFe、1～4 mmol·LMg、30～150 mmol·LK、85～340 mmol·LNa抑制了LZP02生物膜的形成，表現為濃度越高，生物膜形成能力越弱。添加0.5～2.0 mmol·LZn和0.5～2.0 mmol·LCu，沒有觀察到生物膜結構形成。1、4 mmol·LMn促進了LZP02生物膜的形成，而2、3 mmol·LMn對LZP02生物膜形成有抑制作用。

3 結論與討論

為了在競爭根系分泌的營養物質時占優勢，PGPRs首先要在植物根際穩定存活，而PGPR能否在植物根際形成生物膜決定了其在植物根際的定殖能力。本研究發現，LZP02可以在液-氣和固-氣表面形成生物膜。在液-氣表面，24 h開始形成生物膜結構，到48 h形成緊密的生物膜結構。在固-氣表面，LZP02的菌落形態呈現出明顯的具有不同延展性的凸起的褶皺結構。與液-氣和固-氣表面生物膜的形成一致，接種水稻根際2 d后，觀察到LZP02穩定定殖于水稻根際。

sp.在低營養條件(1.0～1.5 g·L蛋白胨)下，生物膜形成最適溫度為30 ℃，最適pH值為6.0。HR10在37 ℃、pH值為7時其生物膜形成能力最強。本研究發現，LZP02在25～40 ℃均能形成生物膜，在30 ℃生物膜形成能力最強，在25 ℃生物膜形成能力最弱，說明低溫會抑制LZP02生物膜的形成?？赡苁且驗榈蜏貤l件下，細菌的生長代謝速率下降。LZP02在pH值為7時生物膜形成能力最強，與文獻報道一致；生物膜結構隨酸堿度而變化，酸性或堿性環境對細菌生物膜形成有顯著影響。LZP02在pH值為4～10時均能形成生物膜，表明LZP02對pH值的變化不敏感，為其在復雜的酸堿土壤環境中穩定存活提供了良好的基礎。

金屬離子對不同細菌生物膜形成影響不同，枯草芽孢桿菌可以吸收金屬離子(Zn、Cu、Fe、Fe、Al)到生物膜基質中，從而避免不同化學環境的侵蝕。NaCl通過滲透作用對生物膜形成產生負面影響，二價陽離子(Ca、Mg)對生物膜形成有促進作用，但高濃度Ca抑制其生長，原因可能是由于細菌生長的減少促使生物膜的形成，或者是高濃度二價陽離子的存在穩定了生物膜中的胞外聚合物。也有研究表明，Ca、Mg提高了生物膜的黏附過程，進而促進生物膜形成。本研究中，K、Na對LZP02生物膜的形成表現出抑制作用，與前人研究結果一致；但是，Ca對LZP02生物膜形成沒有顯著影響，Mg甚至抑制LZP02生物膜的形成。細胞內鐵濃度的增加可以促進SQR9生物膜基質的產生。但本研究中，Fe、Fe均抑制LZP02生物膜的形成，甚至在濃度為1.5～2.0 mmol·L時，沒有觀察到生物膜形成。Zn、Cu顯著抑制LZP02生物膜的形成，與文獻報道的高濃度的Zn、Cu影響細菌的生長相一致。Mn在4 mmol·L時促進了LZP02生物膜的形成，與文獻報道一致，Mn是部分生物膜培養基的組成部分，可以促進枯草芽孢桿菌生物膜的形成。

本研究表明，LZP02具有生物膜形成能力，其形成生物膜的最適培養條件為30 ℃、pH值7；LZP02對不同金屬離子的耐受性較低。