自精保存在輔助生殖技術中的臨床效果分析

陳碧?馬天仲?宋麗君?荊霞?張云山

【摘要】 目的 探討自身精子冷凍保存（自精保存）在輔助生殖技術中的意義。方法 ①對進行自精凍存的73例患者的臨床資料進行回顧性分析， 包括精子凍存原因、凍存精子使用率、復蘇成功率等。②另選同期在本中心接受自精保存作為體外受精（IVF）治療周期患者314例（A組）， 以及夫精人工授精（AIH）術前未行任何干預患者341例（B組）， 觀察兩組取精困難發生率及手術取消率。結果 ①梗阻性無精子癥是自精冷凍的最常見原因， 而且使用率也最高， 為57.9%；其次是嚴重少弱精子癥及取精困難者。但取精困難及嚴重少弱精子癥患者的凍精使用率均較低， 分別為16.7%及6.7%。精子復蘇成功率均>90%， 僅2例梗阻性無精子癥患者精子復蘇后無足夠可用精子而再次穿刺取新鮮精子。②A組患者采卵日發生取精困難者2例， 發生率0.64%， 手術取消率為0；B組患者手術日發生取精困難者8例， 發生率2.35%， 手術取消率為1.17%。結論 自身精子冷凍保存在輔助生殖技術中有重要意義， 特別是在避免梗阻性無精子癥患者遭受不必要的反復侵入性操作及降低因男性取精困難造成的輔助生殖治療周期取消率方面有重要意義。

【關鍵詞】 精子；低溫保存；輔助生殖

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.08.007

Analysis of clinical effect by autologous sperm preservation in assisted reproductive technology CHEN Bi， MA Tian-zhong， SONG Li-jun， et al. Reproduction Center， Affiliated Hospital of Guangdong Medical College， Zhanjiang 524001， China

【Abstract】 Objective To investigate significance of autologous sperm cryopreservation in assisted reproductive technology. Methods ① A retrospective analysis was made on clinical data of 73 patients receiving autologous sperm cryopreservation， including their reasons for autologous sperm cryopreservation， usage rate of cryopreserved sperm， and successful recovery rate. ② There were 314 patients receiving autologous sperm cryopreservation as in-vitro fertilization （IVF） treatment （group A） and 341 patients receiving artificial insemination by husband （AIH） without any preoperative intervention （group B）. Their incidences of semen retrieval difficulty and operation cancellation rates were observed. Results ① As the most common reason in autologous sperm cryopreservation， obstructive azoospermia had the highest usage rate as 57.9%， followed by severe oligoasthenozoospermia and semen retrieval difficulty. However， the usage rates in oligoasthenozoospermia and semen retrieval difficulty were as low as 16.7% and 6.7%. The successful recovery rates in patients were all > 90%， and there were only 2 cases with obstructive azoospermia received puncture semen retrieval. ② There were 2 cases with semen retrieval difficulty in group A， with incidence as 0.64% and operation cancellation rate as 0. There were 8 cases with semen retrieval difficulty in group B， with incidence as 2.35% and operation cancellation rate as 1.17%. Conclusion Autologous sperm cryopreservation shows important significance in assisted reproductive technology， especially for avoiding unnecessary repeated invasive operation in obstructive azoospermia patients and reducing assisted reproductive technology treatment cancellation rate due to semen retrieval difficulty.

【Key words】 Sperm； Cryopreservation； Assisted reproductive technology

隨著人類輔助生殖技術（assisted reproductive technology， ART）的發展， 單精子卵胞漿內注射（intracytoplasmic single sperm injection， ICSI）已漸趨成熟， 理論上只要有一條活動精子， 就能使成熟卵子受精， 使患者受孕。而精子冷凍技術日益成熟， 特別是極少量精子冷凍技術的發展， 使患者因各種因素需要冷凍自身精子用于后續ART治療成為可能。部分男性患者在妻子取卵日由于精神緊張無法取出精液， 導致需行穿刺術取精或冷凍卵子；部分嚴重少弱精及隱匿精子癥患者取卵日無可用精子；梗阻性無精癥患者在門診穿刺檢查時有精子， 但取卵日附睪或睪丸穿刺取精時卻找不到可用精子， 患者除了需忍受兩次穿刺的手術創傷， 還要承受卵子冷凍或取消周期的治療費用的增加；有些患者因自身職業關系， 如海員或執行任務的軍人在取卵日無法到場。因為這些種種因素， 患者要求冷凍自身精子。在2013年4月～2015年4月， 本中心對行輔助生殖技術前因各種因素需行精液冷凍保存的部分患者行自精保存。本文對本中心患者進行回顧性分析， 探討自精保存在輔助生殖技術中的臨床意義， 以及在行人類輔助生殖技術過程中男方取精困難的預防措施， 從而確保助孕順利進行?，F報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2013年4月～2015年4月在廣東醫學院附屬醫院生殖中心行自體精子凍存的男性患者73例。另選同期在本中心接受IVF患者314例（A組）， 其中12例（3.8%）在進入治療周期前表現有明顯取精困難傾向的患者接受主動干預治療；AIH術前未行任何干預的患者341例（B組）， 其中6例（1.8%）手術日突發取精困難的患者接受被動干預治療。精液標本分為射出精子及穿刺精子兩種。射出精子來源于患者手淫或用專用取精套同房取精。精液凍存前需做精液常規分析（參照世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊第5版）， 包括精液量、精子濃度、前向運動精子百分率、正常形態精子百分率及存活率等；所有患者均進行染色體檢查及傳染病篩查。

1. 2 方法

1. 2. 1 標本收集 手淫取精患者禁欲2～7 d， 取精前排尿， 清潔會陰， 手淫法完整采集。標本采集在本中心指定的取精室進行。手淫取精困難者， 可采用特制的避孕套同房進行精液采集。精液需收集到一次性無菌無毒的專用取精杯內。附睪或睪丸穿刺取精者常規消毒鋪巾， 用7號頭皮針穿刺附睪或睪丸， 附睪液加入裝有1 ml精子洗滌培養基（美國Quinns）的培養皿中；睪丸穿刺取精需在解剖鏡下用1 ml注射器針頭撕碎曲細精管， 再置于倒置顯微鏡下觀察有無精子。

1. 2. 2 精子冷凍 逐滴把1份精子冷凍培養基（Quinns AdvantageTM Sperm Freezing Medium）加進1份液化好的精液樣本。每滴培養基加入時， 要不斷混合以確保精子細胞與冷凍培養基能徹底平衡?；旌虾蠓跤?0 min。標記冷凍用的精液貯存管（包括患者姓名和日期）， 分裝孵育過的精液到冷凍管， 每份約1～2 ml， 蓋緊。將冷凍管平放在離液氮面10～20 cm高度20～30 min， 把冷凍管放在鋁架上， 然后移至液氮罐保存。

1. 2. 3 精子解凍 找出需要解凍的精液標本， 雙人核對確認后， 把冷凍管取出， 35℃水浴直至完全溶解。把解凍后的精子溶液倒進試管， 一滴一滴緩慢地在30 s內把3份精子沖洗培養基與精子溶液徹底混合以確保精子冷凍培養基已被稀釋。根據解凍后的精子質量采用相應精液優選方法獲有活力精子。附睪或睪丸穿刺取精者如果未找到活動精子或活動精子過少， 則重新睪丸或附睪穿刺取精；手淫取精者當天先留取新鮮精液， 如無法取出精液或當天精液中未找到活動精子或活動精子過少， 則復蘇精液。

2 結果

2. 1 自2013年4月～2015年4月， 73例男性患者在廣東醫學院附屬醫院生殖中心行自體精子凍存。精液凍存原因分布、冷凍前精液質量、使用率、復蘇成功率見表1。梗阻性無精子癥是自精冷凍的最常見原因， 而且使用率也最高， 為57.9%；其次是嚴重少弱精子癥（15例）， 由于擔心女方取卵日無法取到足夠可用精子而要求冷凍精液；12例取精困難患者因擔心取卵日無精子可用又不愿意選擇凍卵或穿刺術取精要求凍精。但取精困難及嚴重少弱精子癥患者的凍精使用率均較低， 分別為16.7%及6.7%。73例患者的精子復蘇成功率均>90%， 僅2例梗阻性無精子癥患者精子復蘇后無足夠可用精子而再次穿刺取新鮮精子。

2. 2 自精保存對取精困難患者的效果評估 A組314例IVF患者采卵日發生取精困難者2例， 發生率0.64%（2/314）， 需解凍凍存精子， 手術取消率為0。B組341例AIH患者手術日發生取精困難者8例， 發生率2.35%（8/341）， 患者接受被動干預治療， 仍有4例未能成功取精而取消人工授精， 手術取消率為1.17%。

3 討論

隨著ICSI技術的發展， ICSI技術已作為常規技術應用于輔助生殖臨床治療， 給越來越多的不孕癥患者帶來福音。而精液冷凍結合ICSI技術更進一步拓寬了不孕不育的治療范圍。精子的質量及來源不影響ICSI治療的受精及早期妊娠結局[1]。目前對小鼠冷凍精子的胚胎發育和表觀遺傳學的研究發現， 與新鮮精子組相比， 冷凍精子的胚胎的表觀遺傳重組動態進程并沒有改變[2]。目前精子冷凍方法主要有慢速冷凍和玻璃化冷凍， 兩種冷凍方法之間精子活動率下降及DNA損傷無顯著差異[3]。但是常規精子冷凍方案卻不適用于稀少精子冷凍， 解決稀少精子冷凍技術將在很大程度上改善臨床治療少、弱精子癥和無精子癥患者的不育問題。尋找合適冷凍載體是目前稀少精子冷凍的研究重點之一。目前稀少精子不同載體冷凍方法有：空卵膜載體冷凍法、微滴冷凍法及其他微型載體冷凍法[4]。在國內一些人類精子庫已開展腫瘤患者的精液凍存[5]， 拓寬了不孕不育的治療范圍， 給越來越多不孕癥患者帶來福音。

在本院行自精保存的患者中， 梗阻性無精子癥是自精冷凍的最常見原因， 而且使用率也最高， 與張靜雯等[6]報道一致。與自精保存避免了梗阻性無精癥患者在門診穿刺檢查時有精子， 但取卵日附睪或睪丸穿刺取精時卻找不到可用精子?；颊卟恍枞淌軆纱未┐痰氖中g創傷， 以及因卵子冷凍或取消周期而導致治療費用的增加， 減輕了患者經濟負擔。但因附睪或睪丸穿刺取出的精子量較少， 目前極少量精子的冷凍技術仍處于研究階段， 在臨床上尚未能常規應用。目前仍使用傳統的慢速冷凍方法， 考慮到慢速冷凍法中精子的復蘇存活率<50%， 因此要求活動精子的數量要≥10條， 才能保證復蘇后有足夠的精子用于ICSI。

部分男性患者在妻子取卵日由于精神緊張無法取出精液， 導致需行穿刺術取精或冷凍卵子。為確保助孕順利進行， 在妻子進入助孕周期后， 丈夫取精行精液凍存有助于消除患者緊張及不安情緒。采取主動干預措施使取精困難發生率極低， 而且萬一患者手術日無法取出精液， 仍可冷凍精子可用。自精保存對縮短該類患者的助孕周期， 減少助孕費用有積極意義。

總之， 自精保存在行人類輔助生殖技術過程中作為男方取精困難的主動干預措施是有效的， 可確保助孕順利進行。

參考文獻

[1] 劉倩， 吳蓮芝， 謝青貞. 不同精子參數及來源與ICSI結局的相關性研究. 現代婦產科進展， 2013， 22（8）：651-653.

[2] 巢時斌， 李建春， 金萱， 等.小鼠冷凍精子的胚胎發育和表觀遺傳學.中國科學：生命科學， 2012， 23（5）：374-382.

[3] 張靜靜， 章志國， 賀小進， 等.玻璃化冷凍與慢速冷凍對微量精子活動力和DNA完整性的影響.安徽醫學， 2013， 34（5）：533-536.

[4] 陳春華， 沙艷偉， 李萍. 稀少精子冷凍研究進展.中華男科學雜志， 2013， 23（8）：63-69.

[5] 平萍， 朱曉斌， 劉勇， 等. 上海地區男性生殖保險6年回顧性分析. 中國男科學雜志， 2009， 23（8）：41-44.

[6] 張靜雯， 馬文敏， 趙軍， 等. 自精保存在輔助生殖技術中的應用和意義.中國婦幼保健， 2014， 29（12）：1885-1888.

[收稿日期：2015-11-03]