胰島分離的研究進展

程穎（中國醫科大學附屬第一醫院器官移植科，遼寧 沈陽 110001）

成功的胰島移植可以將糖尿病患者的血糖水平維持在正常范圍內，是臨床治療糖尿病的有效手段［1-2］。成功的β細胞代替治療是使受者實現糖代謝正常，脫離外源性胰島素，使糖化血紅蛋白水平（haemoglobin A1c，HbA1c）恢復正常，減輕糖尿病誘導的器官衰竭以及降低因使用外源性胰島素導致嚴重低血糖事件危及生命的風險。受者在接受胰島移植后糖尿病的急性和慢性并發癥將得到緩解，生活質量得到極大改善［3］。

與胰腺移植相比，胰島移植具有并發癥發生率低、手術簡單的優勢，但由于術后多數患者依賴胰島素，臨床沒有大規模開展。20世紀末，胰島分離技術的進步使其為臨床胰島移植項目在全球的發展打開了大門。在Edmonton方案中研究者為糖尿病患者移植多個供體的胰島，通過使用低毒免疫抑制方案使7例受試者脫離了外源性胰島［4］，取得了突破性進展。Edmonton方案也成為胰島移植標準［5-6］。盡管胰島移植取得了重大的進步，實現了移植術后脫離胰島素治療，但大多數受者體內移植胰島隨著時間的推移而被消耗，使胰島移植后5年的胰島素脫離率僅為10%。這種慢性胰島移植物功能的衰減可能與移植物排斥反應和復發性自身免疫反應有關［7］。

胰島分離純化是胰島移植的關鍵步驟，也是決定移植成敗的關鍵。影響胰島分離效果的因素很多，從供體腦死亡到胰島分離過程中，很多環節都會損耗胰島［8］。胰島制備過程包括供體的篩選、胰腺消化、胰島純化及胰島培養等。本文將闡述多種提高胰島分離產量的方法。

1 供者的篩選

很多供體相關因素能夠影響胰島分離結果，包括年齡、致死原因、體重指數（body mass index，BMI）、冷缺血時間、住院治療時間、血管活性藥物的使用情況及血糖水平［9-15］。大多數情況下，較大的胰腺含有較多胰島［16］。因此，胰腺的重量是供體胰島的替代參數，一項研究通過分析345例供體信息得到了預測胰腺重量的公式［17］。研究發現∶① 男性的胰腺比女性更大；② 在40歲之前，胰腺重量隨年齡而增加；③ BMI與胰腺重量之間存在相關性，但與BMI相比，體表面積能更好地預測胰腺重量［18-19］。實驗研究發現，心臟死亡器官捐獻（donation after cardiac death，DCD）來源的胰腺與腦死亡器官捐獻（donation after brain death，DBD）來源的胰腺在分離胰島的產量和功能上相似，但是臨床試驗與該結果不完全一致［20］。日本在DCD供體的器官移植方面經驗豐富，他們在DCD供體來源的胰島移植中報道了第1、2、3年的移植物存活率分別是76.5%、47.1%和33.6%，多次胰島移植的存活率分別是100%、80.0%和57.1%。所有受者未發生嚴重低血糖事件，而且還有3例受體脫離胰島素分別14、79和215天［21］，這表明在DBD來源受限的情況下，DCD可作為分離胰島的重要來源。

2 胰腺組織的消化和酶

胰腺組織的消化采用酶消化分離法，將產生胰島素的胰島和胰腺的外分泌組織分離開。為了促進胰島分離，需要將酶混合物灌注到胰島和外分泌組織的間隙中，消化間隙的結構蛋白——膠原蛋白［22-23］。由于膠原蛋白的致密結構和機械強度，使其通常不能被普通的蛋白酶降解，但能被特異性高的膠原酶有效降解［24］。因此，膠原酶是分離胰島的關鍵成分，但單獨使用膠原酶不能充分消化胰腺組織［25］，這表明非膠原酶成分能促進胰腺的消化。在1990年之前，天然膠原酶是從溶組織梭菌發酵產物中提取出來的，廣泛應用于胰島分離中，這種膠原酶分為2個不同的級別∶CⅠ和CⅡ，包含不定量的淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、殼多糖酶、唾液酸酶、透明質酸酶、脂肪酶和磷脂酶［26-28］。因此，商品化的膠原酶在不同批次間具有成分和活性的差異，從而影響胰島分離的成功率［29-30］。20世紀90年代末，羅氏公司開發了一種經純化的混合酶——Liberase HI，它是由CⅠ和CⅡ組成，并且添加了一種從嗜熱芽孢桿菌中提取的嗜熱菌蛋白酶，減少了不同批次之間酶活性的差異。隨后，Liberase HI應用于實驗和臨床的胰島分離，提高了動物和人胰島分離的產量和活性［31-32］。

溶組織梭菌有2個同源但不同的基因—ColG和 ColH，分別編碼 CⅠ和 CⅡ［33-34］。CⅠ和 CⅡ在結構上完全不同，但這兩種酶的催化作用基本一致［35］。一些研究者認為CⅡ是消化胰腺的關鍵酶而忽略了CⅠ的作用［36］。Kin等［37］的研究表明，與含CⅡ比例較高的酶相比，含CⅠ比例較高的酶能表現出更好的消化效果，研究還發現過多的CⅡ并不會促進人胰島素的釋放，而是需要CⅡ/CⅠ比值適當［38］。

深入研究胰島和外分泌組織之間的結構和成分能促進胰腺消化方法的改進，先前的一些研究闡述了人胰腺內不同類型膠原蛋白的分布情況。膠原蛋白Ⅳ存于導管和腺泡之間的基底膜內［39］，胰島和外分泌組織之間存在的膠原蛋白亞型有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ［40］。Hughes等［41］研究發現，成人胰腺的胰島和外分泌組織之間的膠原蛋白類型主要是膠原蛋白Ⅵ。膠原蛋白Ⅵ含有大量的二硫鍵以保護其結構不易被膠原酶破壞［42］。胰腺膠原蛋白受正常衰老過程的影響，Bedossa等［43］發現超過50歲的受試者體內胰腺膠原蛋白的含量明顯高于青年受試者。因此，對膠原蛋白的深入認識能助于對胰腺消化方法的改進。

2007年，人們發現Liberase膠原酶的生產過程中使用了含牛神經成分的物質，使胰島移植具有潛在傳染朊病毒的風險，很多胰島移植中心出于安全考慮而換用Serva膠原酶，很大地影響了胰島的產量和質量。比較使用Liberase HI 和Collagenase NB1分離人胰島的結果發現，采用Liberase HI分離的人胰島活性更佳［44-45］。采用高效液相色譜法和膠原蛋白降解活性實驗分析了Liberase MTF、CIzyme Collagenase HA和Collagenase NB1，發現CIzyme Collagenase HA具有最強的膠原蛋白降解活性，其次 是 Liberase MTF 和 Collagenase NB1［46］。Balamurugan等［47］詳細地評估了8種不同的酶組合使用對人胰島分離產量的影響。這項研究中249例胰島分離中用到的酶包括純化和未經純化的膠原酶（CⅠ和CⅡ），嗜熱菌蛋白酶及中性蛋白酶。根據酶的生化特征和酶的消化能力，用CⅠ、CⅡ和中性蛋白酶的混合物代替嗜熱菌蛋白酶配制成新的混合酶。與標準混合酶相比，使用這種新的混合酶能從胰腺炎和捐獻的胰腺供體中分離出更多胰島，并能保持良好的胰島活性和功能。Qi等［48］對 Liberase HI、Collagenase NB1/NP 和 MTF C/T進行了研究，通過對比應用這3種酶分離胰島的數量、活性、葡萄糖刺激的胰島素分泌（glucosestimulated insulin secretion，GSIS）、葡萄糖刺激的耗氧量（glucose-stimulated oxygen consumption rate，ΔOCR）及小鼠胰島移植的效果發現，采用MTF C/T分離胰島的各項指標均優于采用Liberase HI 和Collagenase NB1/NP分離的胰島。此外，還有相當多的研究致力于開發非酶的胰腺消化方法，不損傷胰島而選擇性地消化腺泡組織［49］，如采用雙向電流非接觸技術分離胰島［50］。這些混合酶和非酶型的胰島分離技術是否能在臨床胰島移植中應用以及能否改善治療效果至今尚未闡明。

3 胰島純化

人的肝臟具有很強的再生能力和血管重建能力，因此可作為胰島移植部位［51］，而平均每個人的胰腺（90 g）通過酶消化可以得到大于40 ml的胰腺組織，不能以較大組織量注入肝臟中。此外，大量的臨床證據表明，將大量的組織顆粒注入肝臟中會立即引起肝栓塞、血栓、損傷甚至死亡［52］。顯然，為了移植安全只有減少組織量才能將胰島移植到肝臟內。這可以通過胰島純化的操作得到高純度的胰島來實現。

根據密度差異將胰島從外分泌組織中分離出來是一種簡單而有效的胰島純化方法。這種方法的理論基礎是利用胰島（＜1.059 g/ml）和外分泌組織（1.059～1.074 g/ml）之間的密度差異［53］，通過離心使胰島和外分泌組織在連續密度梯度液中分布到自己的密度區間。理論上，胰島和外分泌組織之間存在的密度差異能有效地分離胰島。但是，會有部分胰島沒有完全和外分泌組織分離開，外分泌物質釋放和組織水腫，使外分泌組織的密度下降而不能純化分離到大量高純度的胰島。

COBE 2991的出現迅速提高了胰島純化的產量［54］。其中，最為常用的一種純化介質是聚蔗糖。Scharp等［55］研究發現，去掉Ficoll中低分子量物質能提高胰島純化的產量。UW液能減少腺泡組織水腫［56-58］，Huang等［59］將UW液應用于胰島純化過程中，將UW液和泛影酸鈉加入Ficoll 中制成密度梯度液用于分離胰島，與之前的純化液相比，明顯提高了胰島純化的產量。之后，Barbaro等［60］將UW-Bicoll純化方法進一步改良，采用一個較窄的密度區間純化胰島使其純化效率達到85%。最近的研究發現，在純化過程中應用OptiPrep能減少胰島分泌的促炎因子和趨化因子，并在臨床上取得不錯的成效［61］。McCall等［62］對比了 Ficoll-，histopaque-，dextran-和碘克沙醇的胰島純化實驗，發現使用histopaque不僅能純化出胰島而且花費最低，是一種經濟可行的純化方法。Shimoda等［63］采用了一種大瓶純化技術，以ET-Kyoto和碘克沙醇作為純化液，待純化組織加在純化液的上層，離心使胰島和外分泌組織分離開。這種技術較傳統的分離技術能提高胰島的產量和活性。此外，一些其他的研究使用磁性分離胰島［64］，盡管可以分離豬胰島，且具有臨床應用的潛力，但這項技術如何轉化到臨床應用至今尚未闡明。

4 胰島培養

臨床胰島移植依賴于成功的人胰島分離，然后通過體外培養維持胰島功能直至實行移植手術。雖然在移植實驗中是否應該立即將分離的胰島實行移植有爭議［65］，但將人胰島培養一段時間后進行移植對于臨床治療是有益處的，能夠為患者提供準備時間以及移植前的免疫治療時間，并且在培養期間可以完成各種質量控制實驗（如微生物學檢測和熱源檢測實驗）。一項非常重要的研究領域就是利用一些物質在培養過程中改善胰島活性以及促進移植后的胰島功能，如在培養液中加入抗氧化劑能成功地維持胰島的完整性［66］。胰島分離后極易受到缺氧的損傷［67］，另一項研究領域就是減少培養過程中的缺氧損傷。一些新的生物材料也應用于胰島培養過程中改善胰島活性，如細胞外基質（extracellular matrix，ECM）代替物為胰島提供天然的微環境［68］，還有一些用ECM胰島包被技術、生物支架和生物反應器等。

5 總 結

近幾年，臨床胰島移植技術發展迅速以及免疫抑制治療也取得了很大的進步，使胰島移植受體的5年胰島素脫離率達到60%［69］。目前的研究仍需致力于如何從供體中獲得大量高活性的胰島，使其在受體內長期維持調控血糖的功能。為了實現這一目標還需要付出更多努力，為糖尿病患者帶來福音。