WNK3激酶高表達對白介素-1β誘導HEK293細胞凋亡的保護作用

王德選，葉曉華，余靈芳，林洪洲，莊捷秋，楊青，鄭雯潔

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 小兒腎內科，浙江 溫州 325027）

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WNK3激酶高表達對白介素-1β誘導HEK293細胞凋亡的保護作用

王德選，葉曉華，余靈芳，林洪洲，莊捷秋，楊青，鄭雯潔

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 小兒腎內科，浙江 溫州 325027）

[摘 要]目的：觀察WNK3激酶高表達對白介素-1β（IL-1β）誘導人胚腎細胞（HEK293細胞）凋亡的作用。方法：HEK293細胞分為3組：Vector+NS組、Vector+IL-1β組和WNK3+IL-1β組。Vector+NS組、Vector+IL-1β組轉染對照Vector，WNK3+IL-1β組轉染WNK3。藥物干預時，Vector+NS組加入等量0.9%氯化鈉溶液，Vector+IL-1β組、WNK3+IL-1β組加入10 ng/mL IL-1β。分別于培養0、12、24、36和48 h時，采用CCK-8試劑盒檢測細胞活性。孵育0、18、36 h時應用Western blot法檢測Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9等凋亡蛋白。在IL-1β干預0、30、60 min時采用Western blot法檢測JNK通路蛋白。結果：Vector+IL-1β組在給藥后細胞活性逐漸下降，在48 h達到最低值，WNK3+IL-1β組下降幅度較緩和，與同時間點Vector+IL-1β組比較細胞活性回升，在48 h時差異有統計學意義（P＜0.01）。IL-1β孵育后cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9表達量增加。與36 h的Vector+IL-1β組比較，WNK3+IL-1β組的cleaved Caspase-3顯著減少，2組的cleaved Caspase-9在18 h及36 h時差異亦存在統計學意義（P＜0.05）。WNK3轉染后p-JNK的表達水平較未轉染WNK3組的上升幅度降低（P＜0.05）。結論：IL-1β誘導HEK293細胞活性下降，而轉染WNK3質?？梢杂行孓D部分細胞活性。WNK3激酶通過減少JNK的磷酸化抑制Caspase途徑的活化，減少細胞凋亡，起到在不利條件下保護腎臟細胞的作用。

[關鍵詞]WNK3；JNK；白介素-1β；腎臟；凋亡

腎臟是維持水和電解質平衡的重要臟器，但也極易受到缺血低氧、藥物等各種因素的影響，進而引起腎臟不同細胞的功能受損，甚至細胞凋亡或壞死。WNKs激酶[with no lysis（K）kinase]是一種新型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。研究提示WNKs激酶構成了一些新的信號通路，涉及人體各種離子轉運體和通道的調節[1]。WNK3激酶是WNKs 4個家族成員之一，可在細胞水平上調節鈉氯共轉運子（Na+-Cl--contransporter，NCC）的表達，而腎臟的NCC主要分布于遠曲小管，是腎小管重吸收鈉離子的通道蛋白之一[2]。目前國內外研究[3-4]多傾向于抑制WNK3激酶，進而減少腎臟對鈉離子的吸收，以達到控制高血壓的目的。但也有研究[5-6]顯示WNK3激酶可能對某些細胞的凋亡有一定的保護作用，如子宮頸癌細胞、神經細胞元細胞等，因此，過度抑制WNK3激酶表達可能會帶來一些負效應。WNK3激酶對人腎臟細胞的凋亡有無保護作用，目前鮮見相關報道。本研究主要觀察WNK3對白介素-1β（IL-1β）誘導HEK293細胞凋亡的影響。

1　材料和方法

1.1材料 HEK293細胞（人胚腎細胞）為上海長征醫院梅長林教授惠贈?？瞻讓φ召|粒pCMV-HAVector、重組實驗質粒pCMV-HA-WNK3均由美國EMORY大學腎內科蔡暉教授惠贈。IL-1β（recombinant human IL-1beta，200-01B）購自Peprotech。CCK-8分析試劑盒購于日本Dojindo Laboratories。Caspase-9（可同時檢測cleaved Caspase-9）、Caspase-3、cleaved Caspase-3抗體、p-JNK、t-JNK等抗體均為美國Cell Signal Technology產品。羊抗兔和羊抗鼠二抗購自美國Jackson ImmunoResearch。DMEM、OPTI-MEM培養基為美國Gibco公司產品。胎牛血清購自杭州四季青公司。Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產品。其余試劑均為市售分析純。

1.2CCK-8法檢測不同干預條件下HEK293細胞活性

1.2.1細胞培養：HEK293細胞接種于培養皿中，在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液中傳代培養。細胞培養箱條件為37 ℃，5% CO2及飽和濕度。每2 d更換培養液。取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2細胞分組及轉染：取對數生長期的HEK293細胞懸液傳代于φ6 cm培養皿（分為Vector+NS組、Vector+IL-1β組、WNK3+IL-1β組），根據Lipofectamine 2000試劑盒操作步驟，待細胞生長密度在40%時按表1劑量進行質粒DNA轉染。轉染4 h后換成正常培養液。

表1　細胞分組及質粒DNA轉染劑量表

1.2.3CCK-8法測定細胞活性：細胞轉染4 h后換成正常培養液繼續培養20 h，細胞以1×104個細胞/每孔的密度重新接種于96孔板，參考預實驗及文獻[7]用藥劑量，加藥組培養液為DMEM+10% FBS+10 ng/mL IL-1β，每孔100 μL；對照組培養液為等量DMEM+10% FBS。于37 ℃孵箱中孵育0、12、24、36 和48 h時，換成10 μL CCK-8+100 μL DMEM正常培養液（每個時間點設5個復孔）。以加入等量CCK-8溶液、藥物以及細胞培養液，但不含細胞的孔作為空白對照。在37 ℃細胞培養箱內繼續孵育1.5 h（避光）。使用酶標儀測定每孔的吸光度值（OD值），測定波長為450 nm。細胞活力（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100。A（加藥）：加有CCK8溶液、細胞和藥物溶液的孔的吸光度。A（空白）：加有CCK8溶液和培養基而沒有細胞的孔的吸光度。A（0加藥）：沒有藥物溶液，但加有細胞、CCK-8溶液的孔的吸光度。

1.3WNK3激酶對不同干預條件下HEK293細胞形態學的影響 取1×104的HEK293細胞懸濁液傳代于3 盤φ6 cm培養皿，轉染方案同1.2.2，轉染后20 h再次以1×104懸液分別接種于3盤φ6 cm培養皿，使藥物干預時3盤細胞密度相同，加藥方案見表1。0 h 和36 h時在光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化。

1.4Western blot法測定WNK3激酶過表達對HEK293細胞凋亡蛋白及JNK蛋白的影響

1.4.1細胞干預及蛋白收集：細胞分組及轉染方案同1.2.2，每組3盤，于孵箱中孵育0、18、36 h時收集細胞蛋白檢測Caspase系列凋亡蛋白。另重新按上述方案傳代及轉染3組細胞，在IL-1β干預0、30、60 min時收集細胞，裂解后檢測JNK蛋白。

1.4.2Western blot法測定：預冷PBS洗滌細胞3次，轉入EP管，加入RIPA細胞裂解液。置于冰上裂解30 mim。12 000 r/min低溫離心20 min，吸取上清液至另一離心管。取20 μL用作蛋白定量檢測，其余蛋白作變性處理。方法如下：用80 ℃水浴預熱1 份6×Loading Buffer后，與5份蛋白樣品充分混勻，將混合物于100 ℃中煮沸5 min，以變性蛋白。每孔40 μg蛋白樣品。10%聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳時，每孔加入40 μg蛋白樣品。濃縮膠電壓設定為70 mV，分離膠電壓升至120 mV。冰浴下恒流300 mA轉膜（PVDF膜）90 min，依次孵育一抗（4 ℃過夜，一抗稀釋濃度均為1:1 000）、二抗（室溫，2 h，稀釋濃度1:12 000），ECL顯色。根據蛋白不同選擇相應的曝光時間，使用凝膠圖像處理系統對目的條帶的分子量和凈光密度值進行分析。以上所有實驗重復3次。

1.5統計學處理方法 數據分析采用統計學軟件SPSS20.0。所有定量資料以±s表示。定量資料多組間比較采用ONE-WAY ANOVA；多重比較，方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett T3檢驗。兩因素的分析采用析因分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1CCK-8法檢測WNK3過表達對IL-1β干預下HEK293細胞活性的影響 結果顯示，Vector+NS組予等量0.9%氯化鈉溶液干預0～48 h，細胞活性變化差異無統計學意義（P＞0.05）。而Vector+IL-1β組在給予10 ng/mL IL-1β后細胞活性即開始逐漸下降，在24 h時，與同組0 h時比較差異有統計學意義（P＜0.05），在48 h時達到最低值（P＜0.01）。WNK3+IL-1β組下降幅度較緩和，在36和48 h時與同組0 h時比較差異有統計學意義（均P＜0.05），但與同時間點Vector+IL-1β組比較細胞活性有所回升，在48 h時差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。

表2　IL-1β誘導HEK293細胞不同時間點的活性（n=6，±s，%）

2.2WNK3過表達對IL-1β干預下HEK293細胞形態的影響 結果顯示，在0 h相同接種密度前提下，Vector+IL-1β組36 h細胞密度明顯比Vector+NS組低，其細胞伸張程度較低，部分細胞形態接近圓形，細胞內空泡較多。WNK3+IL-1β組細胞密度較Vector+IL-1β組增高，細胞內空泡減少，且部分細胞呈橢圓形或梭性。見圖1。

2.3WNK3過表達對IL-1β誘導HEK293細胞凋亡各時間點相關凋亡蛋白表達的影響 結果顯示：Vector+ NS組在等量0.9%氯化鈉溶液干預過程中Caspase-3變化差異無統計學意義（P＞0.05），未檢測到剪切后的Caspase-3及Caspase-9。而Vector+IL-1β組在給藥后18 h Caspase-9和Caspase-3表達量開始逐漸下降，干預開始即檢測到較為顯著的cleaved Caspase-9，18 h到達高峰，36 h略有下降，同時在36 h時檢測到較為顯著的cleaved Caspase-3。與36 h的Vector+IL-1β組比較，WNK3+IL-1β組的cleaved Caspase-3顯著減少（蛋白條帶灰度量化值815.80±63.44 vs 350.33±51.52，P＜0.01），2組的cleaved Caspase-9在18 h（791.96±92.26 vs 349.88±97.40）及36 h（308.89±45.76 vs 103.98±36.03）時差異有統計學意義（均P＜0.05）。見圖2。

圖1　WNK3過表達對IL-1β干預下HEK293細胞形態的影響（×200，箭頭示細胞內空泡）

圖2　IL-1β誘導HEK細胞凋亡過程中Caspase-3及Caspase-9蛋白變化

2.4WNK3過表達對HEK293細胞凋亡中JNK通路的影響 結果顯示：Vector+NS組在等量0.9%氯化鈉溶液干預1 h內沒有檢測到顯著的磷酸化JNK（p-JNK），IL-1β干預后，Vector+IL-1β組p-JNK在30 min開始顯著增加。與Vector+IL-1β組比較，WNK3轉染后p-JNK的表達水平在30 min（1 068.67±60.29 vs 603.33±70.94）和60 min（1 183.12±142.91 vs 775.50±107.48）顯著降低（均P＜0.05），見圖3。

圖3　IL-1β誘導HEK細胞凋亡過程JNK通路蛋白變化

3　討論

IL-1β屬多肽類生長因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產生，它能直接啟動凋亡的細胞內過程，具有強烈的誘發細胞凋亡作用[8]。故本實驗選取IL-1β作為激活MAPKS通路及促進細胞內源性凋亡的誘導劑，觀察WNK3對IL-1β誘導的細胞凋亡有無保護作用。CCK-8結果顯示IL-1β能促使HEK293細胞的活性下降，而轉染WNK3可以有效逆轉細胞活性。細胞形態學觀察提示WNK3過表達有利于細胞增殖和細胞形態的維持。

WNK3在體內參與腎臟鈉離子的吸收、細胞骨架形成、細胞凋亡及腫瘤細胞的侵襲轉移等[9-10]。既往研究表明轉染WT（野生型）-WNK3質粒的子宮頸癌細胞，在actinomycin-D誘導凋亡處理下的存活時間顯著長于沒有轉染WT-WNK3質粒的子宮頸癌細胞，表明WNK3可延長細胞存活時間，延緩細胞凋亡[5]。除此之外，有學者報道Lingo-1受體能通過抑制WNK3的活性而促進神經細胞的凋亡，推斷WNK3在神經細胞中也具有抗凋亡作用[6]。

細胞凋亡的外源性途徑的活化是通過特定的死亡配體與細胞表面的死亡受體相互作用而介導的，可招募胞質中的procaspase-8，使其通過自身剪切而活化，激活下游的效應Caspase，如：Caspase-3、Caspase-6等，以剪切胞漿和核底物，誘導細胞發生凋亡。凋亡的內源性途徑主要通過線粒體介導，當細胞受到應激刺激時，一些促凋亡蛋白如Bcl-2等從線粒體被釋放入胞漿，與凋亡激活因子Apaf-1結合，將Caspase-9前體活化，繼而誘導下游Caspase-3 及Caspase-7的活化，引發凋亡程序[11-12]。因此，Caspase-3是兩條途徑的下游共同關鍵調控凋亡蛋白。本研究結果顯示，在10 ng/mL的IL-1β誘導下，HEK293細胞中剪切后的Caspase-9和Caspase-3顯著上調，Caspase-3的剪切體在36 h、Caspase-9剪切體在18 h時表達增強達到高峰，而cleaved Caspase-9在IL-1β誘導36 h時表達反而有一定的降低，這可能是細胞在凋亡晚期時，Caspase已經執行完任務，其生理功能開始降解，細胞大多進入凋亡晚期的情況有關。這說明IL-1β可以通過內源性途徑誘導HEK293細胞發生凋亡。WNK3過表達主要通過凋亡的內源性途徑，抑制Caspase-9前體活化，并使下游Caspase-3活化減少，使相關凋亡蛋白表達程度下降，起到一定的抗凋亡作用。

JNK信號通路是MAPK中重要的通路之一。JNK通路的激活與多種系統的促凋亡作用有關。其中一條途徑是通過磷酸化c-Jun和ATF-2激活轉錄因子AP-1，引起FasL表達增強，促進細胞凋亡。另一途徑是通過磷酸化Bcl-2和Bcl-xL，促進線粒體釋放細胞色素C，從而激活Caspase級聯反應，導致細胞凋亡[13]。本研究中IL-1β激活HEK293細胞的JNK，引起Caspase級聯反應，最終導致細胞凋亡。WNK3過表達主要通過抑制JNK磷酸化，減少Caspase-3、Caspase-9的剪切激活，減輕腎臟細胞凋亡程度，提升HEK293細胞在外界不利因素刺激下的存活率。

總之，WNK3激酶可抑制HEK293細胞的JNK磷酸化，通過Caspase途徑減少腎臟細胞凋亡。雖然目前國際上主流觀點認為WNK3主要負責腎臟鈉離子的吸收，與高血壓的發生發展有關，主要關注如何對其進行下調[14-16]，但本研究也顯示WNK3具有保護腎臟細胞在不利條件下的生存能力，故建議在調控過程中避免對其進行過度抑制，以免影響腎臟細胞生存能力。

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（本文編輯：丁敏嬌）

·論 著·

The protective effect of WNK3kinase on apoptosis in HEK293 cell induced by interleukin-1β

WANG Dex-uan,YE Xiaohua,YU Lingfang,LIN Hongzhou,ZHUANG Jieqiu,YANG Qing,ZHENG Wenjie.Department of Pediatrics,the Second Affi liated & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Abstract:Objective:To observe the effect of high expression of WNK3on apoptosis in HEK293 cells induced by interleukin-1β.Methods:The HEK293 cells were divided into 3 groups (Vector+NS group,Vector+IL-1β group and WNK3+IL-1β group),then tansfection was performed.Liposome 2000 was added to the 1stand 2ndgroup with PCMV-HA-Vector as the blank and negative control respectively; WNK3was added to the 3rdgroup.After treated with 10 ng/mL IL-1β (the 2ndand 3rdgroup) or the same amount of normal saline (the 1stgroup),the CCK8 analysis was performed for the detection of cell activity after incubation for 0 h,12 h,24 h,36 h and 48 h at 37 ℃ respectively.Cell proteins were collected after 0 h,18 h and 36 h incubation respectively for detection of Caspase-3,Cleaved Caspase-3,Caspase-9,Cleaved Caspase-9.In addition,cell protein were collected 0 min,30 min and 60 min after the treatment of IL-1β for JNK detection.Results:No signifi cant difference of cell activity was observed in the Vector+NS group within 48 h.In the Vector+IL-1β group,cell activity began to decline soon after administration.Signifi cant difference could be found after 24 h and the cell activity reached the lowest at 48 h (P＜0.01).Cell activity of WNK3+IL-1β group declined in a moderate manner and the signifi cant difference appeared at 36 h and 48 h when comparing with that at 0 h in the same group (both P＜0.05).However,in comparison with the Vector+IL-1β group at the same time point,cell activity of WNK3+IL-1β group was still a little higher and the signifi cant difference could be observed at 48 h (P＜0.01).The expression of Caspase-9 and Caspase-3 began to decline 18 h after the administration with an increasing peak of cleaved Caspase-9 which decreased slightly at 36 h.An obvious cleaved Caspase-3 could also be observed 36 h after thebook=2,ebook=6administration.In the WNK3+IL-1β group,the decline of Caspase-3 was more moderate when comparing with that in the Vector+IL-1β group.A small quantity of cleaved Caspase-3 could be detected and showed an statistical signifi cance in comparison with that of the same group at 0 h (P＜0.05) with the WNK3; the expression of p-JNK declined but t-JNK did not change.Conclusion:IL-1β may decrease activity of HEK293 cells while transfection of WNK3may partly reverse this affection of IL-1β.The over expression of WNK3may inhibit the activation of JNK pathways induced by IL-1β,decrease the activation of Caspase pathway to reduce apoptosis,and fi nally protect the kidney cells under adverse conditions.

Key words:WNK3; JNK; IL-1β; kidney; apoptosis

通信作者：鄭雯潔，副主任醫師，Email：wzwjzheng@sina.com。

作者簡介：王德選（1977-），男，浙江蒼南人，主治醫師，博士。

基金項目：國家自然科學基金青年基金資助項目（81200513）；錢江人才項目（2011R10049）；溫州市科技局科研基金資助項目（H20110014）。

收稿日期：2015-07-10

[中圖分類號]S941.42

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.01.001