玉米ZmMPK5酵母雙雜交誘餌載體的構建及自激活作用檢測

馬芳芳，王瑞云，蔣明義

(1.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801； 2.南京農業大學 生命科學學院，江蘇 南京 210095)

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玉米ZmMPK5酵母雙雜交誘餌載體的構建及自激活作用檢測

馬芳芳1，2，王瑞云1，蔣明義2

(1.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801； 2.南京農業大學 生命科學學院，江蘇 南京 210095)

摘要：玉米中ZmMPK5參與了ABA誘導的抗氧化防護從而增強了植物對干旱、鹽漬以及氧化脅迫的忍受能力，然而截至目前對其潛在的分子機制卻知之甚少。為構建玉米ZmMPK5酵母雙雜交誘餌表達載體，并檢測其在宿主酵母菌MaV203中的自激活活性和毒性，利用gateway技術，以實驗室保存的重組質粒pMD19T-ZmMPK5為模板，擴增得到帶有attB位點的ZmMPK5基因的ORF片段，通過BP重組反應和LR重組反應，最終將該片段構建到誘餌表達空載體pDEST32上，PCR及測序鑒定結果表明，成功構建了閱讀框方向和序列均正確的重組誘餌載體pDEST32-ZmMPK5。用PEG/LiAc法將重組誘餌質粒pDEST32-ZmMPK5轉化酵母菌株MaV203感受態細胞，通過缺陷型平板表型分析以及X-gal分析實驗檢測誘餌載體表達的蛋白對宿主細胞是否具有毒性和自激活作用。最終結果表明構建的誘餌載體對宿主酵母菌MaV203既無毒性也無自激活活性，可用于后續研究，為進一步利用酵母雙雜交方法從玉米cDNA文庫中篩選與ZmMPK5相互作用蛋白奠定了基礎。

關鍵詞：ZmMPK5；酵母雙雜交；誘餌載體；MaV203；自激活

促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Proein kinase, MAPK)級聯反應是生物體適應外界環境刺激的重要的細胞信號轉導途徑[1,2]。作為級聯途徑中最后一個組成成分，植物MAPK在各種信號轉導中處于核心地位，參與調控了眾多諸如病原物、激素信號、活性氧、干旱、鹽漬、低溫、熱激、滲透脅迫、機械刺激及損傷、O3、紫外、細胞死亡、重金屬、氧化脅迫等信號轉導過程以及植物生長發育過程[3～8]。但目前人們對MAPK是怎樣調控這些過程的卻知之不多。解開MAPK作用機理的關鍵一步是鑒定與MAPK相互作用的蛋白并闡明其在植物體內的生理功能。目前已經明確的MAPK互作蛋白非常有限，因此需要通過一定的技術手段如酵母雙雜交技術來篩選與MAPK相互作用的蛋白，從而更加明確MAPK級聯途徑在植物信號轉導中的機制和作用。

玉米中ZmMPK5屬于MAPK家族的A類蛋白激酶，與OsMPK6、AtMPK6、PsMAPK、NtSIPK同源。前人研究表明ZmMPK5參與了ABA誘導的抗氧化防護從而增強了植物對干旱、鹽漬以及氧化脅迫的忍受能力[9～13]，然而其具體的作用機制尚未明確。由于蛋白質相互作用在生命活動中扮演著重要角色，研究ZmMPK5相互作用蛋白將是闡明其作用機制的有效途徑。

酵母雙雜交系統具有許多優勢，它的一個很重要的功能就是發現新的蛋白質以及發現蛋白質的新功能，即從cDNA文庫中篩選出與已知蛋白相互作用的未知蛋白，進而為探索該蛋白的相關特性及功能奠定基礎[14,15]，而構建有效的誘餌載體是運用酵母雙雜交系統開展蛋白互作研究的重要前提基礎[16～18]。本研究擬通過構建玉米ZmMPK5酵母雙雜交誘餌表達載體，并對其進行毒性和自激活活性的檢測，以期利用誘餌載體從玉米cDNA文庫中篩選與之相互作用的未知蛋白，從而為探索ZmMPK5的新功能提供線索。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1菌株、質粒和載體

大腸桿菌DH5α、pMD19T-ZmMPK5質粒由本實驗室保存；酵母菌MaV203(MATα,leu2-3,112,trp1-901,his3Δ200,ade2-101,gal4Δ,gal80Δ,SPAL10::URA3,GAL1::lacZ,HIS3UAS GAL1::HIS3@LYS2,can1R,cyh2R)、 入門載體質粒pDONR222、誘餌空載質粒pDEST32(含GAL4 DNA-Binding Domain)、獵物空載質粒pDEST22(含GAL4 Transcriptional-Activation Domain)、對照質粒pEXP32/Krevl、pEXP22/RalGDS-wt、pEXP22/RalGDS-m1、pEXP22/RalGDS-m2由 Invitrogen公司提供。

1.1.2主要試劑

PlatinumPfxDNA Polymerase、Gateway?BP ClonaseTMⅡ Enzyme Mix、Gateway? LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix、Proteinase K Solution購自Invitrogen公司；卡那霉素、慶大霉素、鮭魚精DNA、PEG3350、LiAc、3-Amino-1, 2, 4-Triazole(3AT)、X-gal為Sigma公司產品；DNA Marker、Taq DNA Polymerase、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒、酵母質粒提取試劑盒、溶壁酶購自天根生化科技有限公司；酵母培養所用的培養基購自Clontech公司。

1.1.3引物

attB1-ZmMPK5:

5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGC

AGGCTTCATGGACGGCGGGGGGCA-3′

attB2-ZmMPK5:

5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCT GGGTCCTAGCTGAAATTGAACTTTGGCTAC-3′

M13-Forward:

5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′

M13-Reverse:

5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′

Bait-Forward:

5′-AACCGAAGTGCGCCAAGTGTCTG-3′

Bait-Reverse:

5′-AGCCGACAACCTTGATTGGAGAC-3′

所有引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2ZmMPK5誘餌載體的構建

參照Gateway Technology操作手冊，利用Gateway技術，首先使用含attB位點的引物attB1-ZmMPK5和attB2-ZmMPK5擴增pMD19T-ZmMPK5質粒(實驗室保存)，得到attB-flanked ZmMPK5 PCR 產物，經回收純化后與attP-containing donor vector pDONR222即入門載體進行BP重組反應，反應結束后，將產物轉化DH5α感受態細胞，涂布于含卡那霉素抗性LB平板上，37℃培養過夜。次日以M13 Forward和M13 Reverse為引物做菌落PCR鑒定，選取陽性結果，進行測序。提取測序結果正確的重組入門載體質粒，與誘餌表達空載體pDEST32的質粒進行LR重組反應，反應產物轉化DH5α感受態細胞后涂布于含慶大霉素抗性LB平板上，過夜培養，次日以attB1-ZmMPK5和attB2-ZmMPK5為引物做菌落PCR鑒定，選取陽性結果進行測序，最終將測序結果正確的重組誘餌質粒命名為pDEST32-ZmMPK5，同時進行保菌。

1.3酵母感受態細胞的制備及轉化

制備：將酵母菌MaV203劃線于YPDA(Yeast Extract Peptone Dextrose Adenine Hemis-ulfate Medium)平板上，30 ℃倒置培養2～3 d，挑單克隆接種于2 mL YPDA中，過夜培養。12 000 r·min-1，離心15 s，棄上清，1 mL 1×TE重懸沉淀。12 000 r·min-1，離心15 s，棄盡上清，沉淀重懸于100 μL 1×TE/1×LiAc溶液中，即為酵母感受態細胞。

轉化：每100 μL酵母感受態細胞加1 μg質粒、10 μL (100 μg)滅活的鮭魚精DNA、600 μL 1×TE/1×LiAc/40% PEG 3350；30 ℃，200 r·min-1，30 min；加70 μL DMSO混勻，42 ℃熱激15 min，冰浴1 min；12 000 r·min-1離心30 s，棄上清；100 μL 1×TE重懸沉淀，涂于相應SD缺陷型平板；30 ℃培養2～3天。

不同質粒轉化樣品如下：單轉pDEST32；單轉 pDEST32-ZmMPK5；共轉pDEST32-ZmMPK5和pDEST-22；空白對照：共轉pDEST-32和pDEST-22；強陽性對照：共轉pEXP32/Krel和pEXP22/RalGDS-wt；弱陽性對照：共轉pEXP32/Krev1和pEXP22/RalGDS-m1；陰性對照：共轉pEXP32/Krev1和pEXP22/RalGDS-m2。

1.4含誘餌質粒酵母菌的鑒定

單轉誘餌質粒pDEST32-ZmMPK5至酵母感受態細胞(以單轉pDEST32空載質粒作為對照)，SD-Leu平板上30 ℃培養；待菌落明顯長出后，挑取單克隆接種于5 mL SD-Leu；30 ℃，200 r·min-1過夜培養；其中4 mL菌液進行酵母質粒的提取，以Bait Forward和Bait Reverse為引物做質粒PCR鑒定；將鑒定為陽性的剩余酵母菌菌液進行保菌，即加甘油至終濃度為25%，-80 ℃保存。

1.5誘餌質粒毒性檢測

將單轉pDEST32-ZmMPK5誘餌質粒和單轉pDEST32空載質粒(對照)的酵母菌按照相同條件涂布在SD-Leu平板上，30 ℃培養，針對兩者的菌落生長速度、大小、數目、形態等特征進行觀察。分別挑取二者的單克隆，并按相同條件接種于SD-Leu液體培養基，30 ℃，200 r·min-1培養16～18 h后，檢測兩者的OD600。

1.63AT濃度檢測誘餌載體自激活活性

按照1.3方法，分別共轉化pDEST32-ZmMPK5和pDEST-22、空白對照、強陽性對照、弱陽性對照、陰性對照；待不同轉化的SD-Leu-Trp平板上菌落明顯長出后，制備Master板，即分別挑取不同轉化的兩個單克隆在同一SD-Leu-Trp平板上劃短線；30 ℃培養18 h后，用無菌絨布將Master板上的菌落復制到含不同濃度(0、10、25、50、75、100 mM)3AT的SD-Leu-Trp-His平板上，復制后馬上清試，30 ℃培養24 h后再清試一遍；30 ℃培養48 h后觀察結果。

1.7誘餌載體自激活作用再驗證(X-gal分析檢測lacZ基因表達情況)

按照1.3方法，分別共轉化pDEST32-ZmMPK5和pDEST-22、空白對照、強陽性對照、弱陽性對照、陰性對照；同1.6方法制備Master板，30 ℃培養18 h；取適當大小無菌NC膜平鋪于YPDA平板的培養基上，用無菌絨布將Master板上的菌落復制到YPDA平板中的NC膜上；30 ℃培養24 h后將膜取出并浸泡于液氮中15 s，使膜上的菌落固定；用鑷子小心地將膜取出并平鋪到浸潤了Z buffer/X-gal溶液(16.1 g·L-1Na2HPO4·7H2O，5.50 g·L-1Na3PO4·H2O，0.75 g·L-1KCl，0.246 g·L-1MgSO4·7H2O，20 g·L-1X-gal)的濾紙上，37 ℃孵育8 h，觀察顏色變化。

2結果與分析

2.1ZmMPK5誘餌載體的構建和鑒定

參照Gateway Technology操作手冊，首先獲得attB-flanked ZmMPK5 全長PCR產物，通過BP重組反應獲得入門載體pDONR222-ZmMPK5，將測序結果正確的入門質粒和誘餌空質粒pDEST32進行LR重組反應，轉化子以attB1-ZmMPK5和attB2-ZmMPK5為引物做菌落PCR鑒定，結果顯示(圖1)，成功擴增了大小為1 200 bp的ZmMPK5全長片段。選取陽性克隆進行測序并對測序結果進行分析，最終的結果表明獲得了與預期相符的序列及讀碼框均正確的與GAL4 DNA-Binding Domain相融合的誘餌表達載體pDEST32-ZmMPK5。

圖1　誘餌表達載體pDEST32-ZmMPK5的PCR電泳鑒定Fig.1　PCR products of pDEST32-ZmMPK5　　注：1.DNA分子質量標準250 bp DNA ladder; 2.PCR產物Note: 1.250 bp DNA ladder; 2.The electrophoresis results of pDEST32-ZmMPK5 PCR products

2.2含誘餌質粒酵母菌的鑒定

酵母感受態細胞轉化誘餌質粒pDEST32-ZmMPK5，以轉化pDEST32空載作為對照，涂于SD-Leu平板，待菌落長出后分別挑取兩者的單克隆于5 mL SD-Leu培養基中，30 ℃搖菌過夜，次日提取酵母質粒，以Bait Forward和Bait Reverse為引物做質粒PCR鑒定。圖2結果顯示對照質粒的PCR產物大小為550 bp，而誘餌質粒PCR產物大小為1 750 bp，即ZmMPK5 全長1 200 bp與載體上的一段550 bp的和，結果表明誘餌質粒pDEST32-ZmMPK5已轉化進入酵母菌中，成功獲得了含誘餌質粒的酵母菌。

圖2　誘餌質粒PCR電泳鑒定Fig.2　PCR products of Bait plasmind　　注：1.DNA分子質量標準Marker Ш; 2.誘餌質粒PCR產物; 3.空載質粒PCR產物Note: 1.DNA Marker Ш; 2.PCR products of pDEST32-ZmMPK5; 3.PCR products of pDEST32

2.3誘餌質粒毒性檢測

將轉化了誘餌質粒pDEST32-ZmMPK5和轉化了空載質粒pDEST32的酵母菌按照相同的條件涂布在SD-Leu平板上，30 ℃培養2～5 d，觀察二者的生長狀態，結果顯示：轉化誘餌質粒的酵母菌同對照相比，兩者在菌落生長速度、大小、形態以及數目上并沒有明顯的差異。另外，分別挑取二者的單克隆，按照相同的條件接菌于SD-Leu液體培養基，30 ℃，200 r·min-1培養16～18 h后檢測OD600，結果顯示：兩者的OD600值均達到0.8以上。以上結果表明，轉化了誘餌質粒的酵母菌可以正常生長，誘餌質粒所表達的融合蛋白對宿主酵母菌MaV203本身沒有毒性，可以繼續用于后續的篩庫工作。

2.43-AT濃度檢測誘餌載體自激活活性

根據ProQuestTMTwo-Hybrid System(invitrogen)，我們通過HIS3報告基因的表達與否來檢測誘餌載體的自激活活性。HIS3編碼的酶參與組氨酸的生物合成，它的作用可以被特異性競爭抑制劑3AT所抑制。 如果誘餌載體本身或者與獵物空載體共同作用后有激活作用，那么HIS3報告基因的轉錄就被激活，轉化后的酵母菌就能夠在缺陷型平板SD-Leu-Trp-His上生長[15]。由于酵母菌株本身也有低水平的HIS3表達，為了消除本底干擾，我們通過在培養基中加入適量濃度的3AT，以抑制菌株自身低水平HIS3的表達。本實驗中我們在三缺平板SD-Leu-Trp-His培養基中分別添加了0 、10 、25 、50 、75 和100 mM 6個濃度3AT，從圖3可以看出，誘餌質粒pDEST32-ZmMPK5與獵物空質粒pDEST22共轉化后，在含0、10、25 mM 3AT平板上都有生長，但隨著濃度的增加，菌落生長逐漸受到抑制，當濃度達到50 mM時菌落剛好在上面不生長，表明誘餌質粒在此濃度下對宿主酵母菌無自激活作用，且后續篩庫及相關鑒定試驗中均應使用50 mM濃度3AT。

圖3　3AT濃度檢測誘餌載體自激活作用結果Fig.3　3AT concentration sensitivity determination for testing Bait　　注：1.強陽性對照; 2.弱陽性對照; 3.陰性對照; 4.空白對照; 5.pDEST32-ZmMPK5+pDEST22共轉化。A. B. C. D. E. F. 分別為0、10、25、50、75、100 mM 3AT濃度的SD-Leu-Trp-His+3AT平板。Note: 1.Strong positive interaction control; 2.Weak positive interaction control; 3.Negative interaction control; 4.Negative self-activation control; 5.Test of self-activation.A. B. C. D. E. F. 0、10、25、50、75、100 mM 3AT SD-Leu-Trp-His+3AT plate respectively.

2.5X-gal assay 再驗證誘餌載體自激活活性

根據ProQuestTMTwo-Hybrid System(invitrogen)，我們還可以通過LacZ報告基因是否表達來進一步檢測誘餌載體的自激活活性。如果誘餌載體本身或者與獵物空載體共同作用后有激活作用，那么LacZ報告基因的轉錄就會被激活，該基因編碼的β-半乳糖苷酶以X-gal為底物進行染色反應時呈現藍色[15]。圖4結果顯示，NC膜上的酵母菌體經液氮固定后，37 ℃孵育8 h，通過Z buffer/X-gal溶液進行顯色時，強陽性對照在半小時之內就很快變藍，弱陽性對照則為較淺的藍色，陰性對照和空白對照始終不變藍，而誘餌質粒pDEST32-ZmMPK5與獵物空質粒pDEST22共轉化后的菌落8 h之內也沒有變藍，從而進一步說明了誘餌載體pDEST32-ZmMPK5在宿主酵母菌內無自激活活性。

圖4　X-gal驗證誘餌質粒自激活作用結果Fig.4　X-gal assay for testing of self-activation　　注：1.強陽性對照; 2.弱陽性對照; 3.陰性對照; 4.空白對照; 5.pDEST32-ZmMPK5+pDEST22共轉化。Note: 1.Strong positive interaction control; 2.Weak positive interaction control; 3.Negative interaction control; 4.Negative self-activation control; 5.Test of self-activation.

3討論與結論

以往針對MAPK的研究主要集中在其活性調控方面，然而近年來備受矚目的是一些MAPK下游互作靶蛋白的發現，這些發現將MAPK的功能拓展到了新的領域。擬南芥中AtMYB41被AtMPK6磷酸化而激活，參與了鹽脅迫響應，提高了植株的鹽脅迫忍耐力[19]。Singh等以水稻為材料，通過酵母雙雜交技術篩選出80對MAPK蛋白互作組，構建了第一個水稻MAPK蛋白質相互作用網絡圖譜[20]。植物細胞中還可能存在更多的MAPK底物，這些可能的底物包括轉錄因子、轉錄調節子、剪接因子、受體、組蛋白等[21,22]。然而這些可能的MAPK底物在植物體內的生理功能及其參與的信號轉導途徑仍有待闡明。

酵母雙雜交系統目前被廣泛應用于植物功能基因組及蛋白組的研究當中，通過該方法可以快速而高效地分析蛋白質間相互作用。但是由于某些蛋白本身具有激活轉錄功能或在酵母細胞中表達時能夠發揮轉錄激活作用，使之成為酵母雙雜交系統假陽性率高的一個重要原因之一[15,23]。減少篩選背景降低假陽性是酵母雙雜交實驗的一個關鍵內容。因此，在構建誘餌載體之后，要確定誘餌質粒轉入酵母菌表達的誘餌蛋白沒有自激活作用[23～25]。另外還需檢測誘餌蛋白是否對宿主酵母菌的生長產生毒性，這樣才能夠確定誘餌載體能否用于后續的篩庫試驗。

本研究將玉米ZmMPK5全長ORF與含有含GAL4 DNA-Bingding Domain的pDEST32載體重組，通過PCR鑒定及序列測定表明誘餌載體pDEST32-ZmMPK5構建成功。經毒性檢測，轉化了誘餌質粒的酵母菌同對照相比，兩者在菌落生長速度、大小、形態以及數目上并沒有明顯的差異，表明誘餌質粒所表達的融合蛋白對宿主酵母菌MaV203本身沒有毒性。為了排除誘餌質粒表達的蛋白是否具有激活酵母細胞中報告基因的可能性，即檢測誘餌蛋白的自激活性[25]，本研究對該酵母系統中HIS3報告基因進行了檢驗，通過含不同濃度3AT缺陷型平板測試實驗，結果表明誘餌質粒在50 mM 3AT濃度下背景干擾最小，對宿主酵母菌無自激活作用。為了進一步檢測誘餌載體的自激活活性，我們還通過LacZ報告基因的表達與否進行了驗證。最終結果顯示，與陽性對照相比誘餌載體不會出現顯色反應，說明誘餌質粒pDEST32-ZmMPK5在宿主酵母菌內不能激活LacZ報告基因的表達，誘餌蛋白本身沒有自激活活性。

綜上結果，玉米ZmMPK5酵母雙雜交誘餌表達載體成功構建，誘餌蛋白表達穩定，對宿主酵母細胞既無毒性也無自激活活性，可作為誘餌蛋白使用，為后續利用酵母雙雜交系統篩選與ZmMPK5相互作用蛋白提供了有力的實驗基礎。

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(編輯：邢國芳)

Construction and self-activation detection of bait vector ofZmMPK5 in yeast two-hybrid system

Ma Fangfang1,2, Wang Ruiyun1, Jiang Mingyi2

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.CollegeofLifeSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

Abstract:In maize (Zea mays), the mitogen-activated protein kinase ZmMPK5 has been shown to be involved in abscisic acid (ABA)-induced antioxidant defence, and to enhance the tolerance of plants to drought, salt stress and oxidative stress. However, the underlying molecular mechanisms were poorly understood. In order to construct the bait vector of ZmMPK5 in yeast two-hybrid system and detect its self-activation and toxicity in the host yeast strain MaV203, attB-flanked ORF fragment of ZmMPK5 was amplified using pMD19T-ZmMPK5 as DNA template. The fragment was then successfully fused into PDEST32 vector by BP and LR recombination reaction using gateway technology. The constructed bait plasmid of pDEST32-ZmMPK5 was transformed into MaV203 competent cells by PEG/LiAc method and the toxicity and self-activation of the bait vector was tested by the phenotype analysis and X-gal assay. Final results showed that the bait vector pDEST32-ZmMPK5 had no toxicity and self-activation to the host yeast strain MaV203, and could be used for further research of screening interacting protein of ZmMPK5 from maize cDNA library by yeast two-hybrid technology.

Key words:ZmMPK5； Yeast two-hybrid； Bait vector； MaV203； Self-activation

中圖分類號：S513；Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)03-0170-06

基金項目：國家自然科學基金(30970238)；山西農業大學博士啟動基金(2013YJ04)；山西農業大學科技創新基金(2014022、2014YZ2-5)

作者簡介：馬芳芳(1984-)，女(回)，山西長治人，講師，博士，研究方向：植物逆境生理和分子生物學

收稿日期：2015-12-08修回日期：2015-12-30