狹葉柴胡愈傷組織和懸浮細胞成分的UPLC/Q-TOF-MS分析

程玉鵬 ，李天聰，高寧，王博，田蓓蓓，王瑤

(1.黑龍江中醫藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150024)

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狹葉柴胡愈傷組織和懸浮細胞成分的UPLC/Q-TOF-MS分析

程玉鵬1 ，2，李天聰1，高寧1，王博1，田蓓蓓1，王瑤1

(1.黑龍江中醫藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150024)

摘要：以柴胡皂苷d(SSd)為檢測指標，基于超高效液相色譜聯用四級桿串聯飛行時間質譜儀(UPLC/Q-TOF-MS)，建立狹葉柴胡愈傷組織及懸浮細胞成分定性分析的方法。采用C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，以0.1%甲酸-乙腈為流動相梯度洗脫，使用ESI離子源，正離子模式下采集數據，結合對照品SSd譜圖，分析相關文獻數據對照。結果表明：在UPLC/Q-TOF-MS檢測下，狹葉柴胡懸浮細胞、細胞發酵液及愈傷組織在洗脫時間為11.22、11.19及11.17 min時均與標準品SSd(11.12 min)有相同的裂解碎片，愈傷組織及懸浮細胞中均含有活性成分SSd。相比傳統的高效液相檢測方法，該方法快速、準確且靈敏度好，適用于柴胡組織培養物中活性成分的檢測和分析。

關鍵詞：狹葉柴胡；愈傷組織；懸浮細胞；柴胡皂苷d；UPLC/Q-TOF-MS

狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.為傘形科(Umbelliferae) 柴胡屬(BupleurumL.) 多年生草本植物，入藥部位是柴胡干燥的根，其主要有效成分為柴胡皂苷類化合物[1,2]?，F代藥理學研究表明狹葉柴胡具有解熱、鎮靜、抗炎抗菌、保肝利膽、降血壓、抗腫瘤及促進免疫功能的作用[3]。 然而柴胡對生長環境要求苛刻，且入藥部位特殊(根及根莖)，加之人們過度采挖，使柴胡資源供不應求[4]。因此，有必要考慮開發其他途徑來獲得更多的柴胡資源以及柴胡中的有效活性成分，以維持其可持續發展。愈傷組織培養技術和植物懸浮細胞培養技術都是現代生物技術開發植物資源的重要手段[5,6]，是保護枯竭中藥資源的有效方法[7]。目前通過愈傷組織和懸浮細胞培養提取次生代謝產物進行成分分析在柴胡上還未見報道。課題組前期用HPLC檢測狹葉柴胡愈傷組織和懸浮細胞中柴胡皂苷d 時，未能檢出柴胡皂苷d。造成這一結果可能是因為植物次生代謝是植物在長期進化中對生態環境適應的過程，其代謝產物是宿主抵御外侵和提高自身抗性的結果，然而，在人工培育過程中其代謝能力減弱，活性成分含量降低，故而不易檢測。

色譜具有分離效率高、分析速度快、選擇性好、重復性好等優點。質譜具有較高的特異性和檢測靈敏度，可提供高分辨率和準確度的數據，能較好捕獲色譜峰的準分子離子及碎片離子等信息，有利于色譜峰的鑒定，是中藥活性成分研究的最有效的分析手段之一。超高效液相色譜聯用四級桿串聯飛行時間質譜儀(UPLC/Q-TOF-MS)結合了色譜和質譜的優點，實現時間和空間的在線聯用，是一種在定性分析中具有獨特優勢的聯用技術。

本實驗對狹葉柴胡懸浮細胞培養的條件進行優化，以建立一個快速生長的穩定的柴胡懸浮細胞培養體系。利用高度靈敏的UPLC/Q-TOF-MS對狹葉柴胡愈傷組織及懸浮細胞的化學成分進行分析，以期利用植物組培技術及發酵技術來獲取柴胡中的活性成分，并為開發生物藥物提供依據。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

柴胡皂苷d對照品(中國食品藥品檢定研究院)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，氨水(分析純)，乙醇(分析純)，甲酸鈉(Sigma)，亮氨酸-腦啡肽(Sigma)，自制雙蒸餾水等。

超高效液相串聯四級桿飛行時間質譜聯用儀(美國Waters公司)，MassLynx 工作站(Waters)，分析型色譜柱：美國ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)，0.22 μm溶劑過濾器，AE240型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，HVE-50自動高壓滅菌器(日本平山制造有限公司)，Milli-Q超純水系統(Millipore)。

1.2試劑與儀器

1.2.1愈傷誘導及懸浮細胞的制備

將柴胡種子進行萌發，取下胚軸在附加6-BA 3 mg·L-1，2,4-D 0.1 mg·L-1，KT 0.6 mg·L-1的MS固體培養基上誘導形成愈傷組織，進而將愈傷組織接入MS + 6-BA 2.5 mg·L-1+ 2,4-D 0.1 mg·L-1+KT 0.9 mg·L-1的液體培養基中進行懸浮培養獲得穩定的懸浮細胞系。

1.2.2供試品溶液的制備

收集前期培養的愈傷組織及懸浮細胞于60 ℃烘干至恒重，研磨至粉末狀，分別精密稱取1.0 g裝入圓底燒瓶中，加入60 mL 5% 氨水的70%乙醇，80 ℃回流提取2次，每次1 h。濾過，合并濾液。揮干，加甲醇溶解，得供試品。懸浮細胞發酵液用飽和正丁醇萃取兩遍，揮去有機溶劑，得殘渣，甲醇溶解，得供試品。所得濾液經0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.2.3柴胡皂苷d對照品溶液的制備

精密稱取柴胡皂苷d 0.012 5 g，用甲醇定容25 mL容量瓶中。配制成0.5 g·L-1的對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3檢測條件

1.3.1色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)超高效液相色譜柱，采用正離子模式色譜條件對供試樣品進行檢測，流動相：A為0.1% 的甲酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序：0～1 min，2%～10% B；1～4 min，10% B；4～12 min，10%～70% B；12～14 min，70%～98% B；14～15 min，98%～2% B；15～17 min，2% B，流速0.4 mL·min-1，進樣量4 μL，柱溫40℃。

1.3.2質譜條件

采用Micromass Q-TOF microTM質譜在正離子模式下對樣品檢測，質譜參數為：電噴霧離子源為ESI源，脫溶劑氣流量650 L·h-1，脫溶劑溫度為350 ℃，錐孔氣流量為50 L·h-1，離子源溫度為120℃，正離子模式毛細管電壓分別為3.0 kV，錐孔電壓25 kV，撞能量6 V，交替進行每0.2 s采集一次譜圖，中間間隔0.02 s。鎖定質量溶液：亮氨酸-腦啡肽(leueine-enkephalin, [M+H]+=556.2771, [M-H]-=554.2615)，目的是確保分析的精確性和可重復性，該鎖定質量溶液濃度為40 μg·L-1，流速為15 μL·min-1，掃描間隔10 s。樣品進樣量10 μL，正離子模式下檢測，掃描范圍100～1 000 Da。

2結果

2.1狹葉愈傷組織及懸浮細胞最優培養條件

前期實驗通過使用不同激素不同配比，篩選出愈傷組織誘導和懸浮細胞培養的最佳條件，結果表明：愈傷組織在6-BA 3mg·L-1，2,4-D 0.1 mg·L-1，KT 0.6 mg·L-1的MS固體培養基上生長狀態良好。取生長均勻、質地松散的愈傷組織在MS + 6-BA 2.5 mg·L-1+ 2,4-D 0.1 mg·L-1+ KT 0.9 mg·L-1的培養液中進行懸浮培養，獲得快速生長的穩定的狹葉柴胡懸浮細胞系(圖1)。

圖1　愈傷組織及懸浮細胞系Fig.1　Callus and suspension cells

2.2UPLC/Q-TOF-MS對樣品化學成分的檢測

本實驗以柴胡皂苷d為指標對狹葉柴胡愈傷組織、懸浮細胞及其細胞發酵液的代謝產物進行檢測。結果表明：懸浮細胞、細胞發酵液及愈傷組織的代謝產物在洗脫時間為11.22、11.19及11.17 min時，與對照品SSd(11.12 min)有相同的裂解碎片，m/z分別為763.44, 455.35和 601.4(圖2、圖3)。

圖2　柴胡皂苷d標準品譜圖Fig.2　Spectrogram of the saikosaponin d

圖3　樣品中的柴胡皂苷d(箭頭所指)的陽離子模式總離子色譜Fig.3　Total ion chromatogram of the saikosaponin d in positive mode

3討論與結論

在愈傷組織的誘導和懸浮細胞培養過程中，培養基中激素的種類及配比起著關鍵的作用，不同的激素對植物的刺激效果不同。常用的細胞分裂素是KT和6-BA，生長素是IAA、NAA 和2,4-D[8,9]。根據不同的材料，添加適宜的激素種類和濃度，不僅能夠有效的促進植物細胞的增殖分化，也有利于促進植物次生代謝產物的合成。此外，在建立懸浮細胞培養體系過程中，愈傷組織的選擇尤為重要，生長均勻、質地松散的愈傷組織為細胞懸浮培養的最佳選擇。

狹葉柴胡中含有皂苷、黃酮、多糖、甾醇及揮發油等有效成分，其主要藥效成分為柴胡皂苷a與d，其中柴胡皂苷d的藥理活性廣泛[10,11]，且柴胡提取物中柴胡皂苷d的含量高于柴胡皂苷a的含量[12]，故本實驗選擇柴胡皂苷d作為檢測指標的對照品。柴胡皂苷d屬于五環三萜皂苷，其13位和28位形成環氧環結構， 在提取過程易中受酚類或酸性成分的影響，使環氧醚鍵開環[13]，因而通常采用弱堿性溶劑提取柴胡皂苷可保護氧橋免于水解。由于柴胡皂苷紫外吸收很弱或無紫外吸收，通常利用紫外檢測器檢測柴胡皂苷的有效波長要低于210 nm，但仍存在吸收較弱和干擾較多的問題[14,15]，飛行時間質譜(Q-TOF)作為檢測器可以有效地解決上述問題。此外，課題組前期用HPLC在檢測狹葉柴胡愈傷組織和懸浮細胞中柴胡皂苷d 時，發現樣品柴胡皂苷d未能檢出。這是由于其含量很低，不易檢測。相比傳統的高效液相系統，超高效液相系統能顯著的縮短分析時間，提高分析效率，增強檢測靈敏度。故此，本實驗所選用的UPLC/Q-TOF-MS能夠準確、簡便、快速地檢測柴胡愈傷組織及懸浮細胞中的柴胡皂苷d。

通過合理的利用植物愈傷組織培養及懸浮細胞培養技術，經不斷的優化培養，將會獲得更多的植物材料以解決柴胡資源日益緊缺的現狀，且利用愈傷組織和懸浮細胞的技術來獲取藥效活性成分，具有成本低、生產周期短、不受自然條件影響的優勢。然而有些植物細胞的生理生化特性還未完全被人們所認識，植物細胞培養體系中普遍存在細胞系不穩定，細胞生長緩慢等特點，而且目標產物含量極低，不易檢測[16,17]。UPLC/Q-TOF-MS具有高速采樣速度的靈敏檢測器，在同樣條件下UPLC能分離的色譜峰比HPLC多出一倍還多，此外，飛行時間質譜儀可檢測的分子量范圍大，掃描速度快，TOF-MS在每次進樣時，可采集樣本中所有的m/z,因此UPLC/Q-TOF-MS能對樣本中微少含量的成分進行檢測，并同時檢測多個碎片離子峰，其結果具有一定的可靠性。目前通過利用UPLC/Q-TOF-MS技術對柴胡愈傷組織和懸浮細胞及細胞培養液的有效成分分析還未見報道。由于多數情況下植物細胞培養合成某些有效成分的能力低且不穩定[18]，因此在后期實驗工作中我們將進一步篩選高產細胞系、深入研究活性成分的生物合成途徑，以及對培養條件進行優化等。

總之，本實驗主要利用UPLC/Q-TOF-MS對狹葉柴胡愈傷組織、懸浮細胞的有效成分進行分析，其乙醇提取物檢測結果表明在狹葉柴胡的愈傷組織、懸浮細胞及細胞培養液中均可檢測到柴胡皂苷d。這一結果為獲取狹葉柴胡藥效活性成分，以期為利用植物組培技術開發生物藥物提供依據，進而更好的解決柴胡資源短缺的問題，為今后工業化生產奠定基礎。

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(編輯：馬榮博)

Analysis on compounds of callus and suspension cell ofBupleurumscorzonerifoliumWilld. by UPLC/Q-TOF-MS

Cheng Yupeng1,2, Li Tiancong1, Gao Ning1, Wang Bo1, Tian Beibei1, Wang Yao1

(1．CollegeofPharmacy,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040，China; 2．CollegeoflifeScienceandTechnology,HarbinNormalUniversity,Harbin150024，China)

Abstract:To establish the qualitative analysis method using UPLC/Q-TOF-MS for bioactive compound of saikosaponin d (SSd) in callus and suspension cell of Bupleurum scorzonerifolium Willd.. C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) column was adopted under the ESI positive mode eluting gradiently with 0.1% formic acid -methyl cyanide. The data were collected and comparatively analyzed with references saikosaponin d and relevant literatures. The results showed that suspension cell, cell supernatant and callus had the same fragments as SSd (11.12 min) at 11.22, 11.19 and 11.17 min, respectively. This indicated that callus and suspension cell can produce SSd. Compared with traditional HPLC method, UPLC/Q-TOF-MS method was quick, precise and highly sensitive, which could be suitable for detection and analysis of bioactive compounds of tissue cultures of B. scorzonerifolium Willd.

Key words:Bupleurum scorzonerifolium Willd.; Callus; Suspension cell; Saikosaponin d; UPLC/Q-TOF-MS

中圖分類號：Q813.1； R284.1

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)03-0186-05

基金項目：黑龍江省教育廳基金(12531621)

作者簡介：程玉鵬(1966-)，男(漢)，黑龍江哈爾濱人，副教授，博士，研究方向：內生真菌與宿主間的代謝交流。

收稿日期：2015-12-13修回日期：2015-12-30