枯草芽孢桿菌D-29對采后梨褐腐病的抑制效果研究

王丹，姚曉東，郝曉娟，曹揮，李新鳳，王建明

(山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801)

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枯草芽孢桿菌D-29對采后梨褐腐病的抑制效果研究

王丹，姚曉東，郝曉娟*，曹揮，李新鳳，王建明

(山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801)

摘要：為探究枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)D-29對采后病害的抑制效果，本研究以梨為試驗對象，以果生鏈核盤菌(Monilinia fructigena)為病原菌，通過在果實傷口上接種不同處理的D-29處理液測定其對采后梨褐腐病的抑制效果，監測D-29菌體在果實傷口上數量的動態變化。結果表明，D-29菌懸液可有效降低梨褐腐病的發病率，濃度越大，抑制效果越明顯；先接種D-29菌懸液的處理組，果實的發病率明顯低于先接種病原菌孢懸液的處理組，對病斑擴展的抑制率明顯高于先接種病原菌孢懸液的處理組，且在先接種D-29菌懸液的處理組中，與接種病原菌孢懸液的時間間隔越長，抑菌效果越好；D-29+無菌水及D-29+病原菌孢懸液兩種處理下，D-29菌體均能在短時間內在果實傷口上定殖。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；梨；褐腐??；生物防治

果蔬與人們的生活息息相關，其采后病害造成的損失逐漸引起了人們的關注，成為一項亟待解決的問題。目前防治病害侵染的方法有物理防治、化學防治及生物防治，主要以化學防治為主[1]。但化學農藥的長期過量使用導致果蔬病原菌抗藥性增強及毒物殘留量的增加，對生態環境和人畜的健康造成威脅[2,3]?；趯瘜W殺菌劑日益加劇的限制要求，以及20世紀80年代以來抗病蟲害及農作物大田病害生物防治蓬勃發展的帶動下，果蔬采后病害的生物防治受到重視，逐漸成為國內外學者的研究熱點[4～7]。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一類具有生長快、營養簡單、產生抗逆芽孢、對人畜無害、對環境友好等突出特征的生防細菌[8]，目前已有多種枯草芽孢桿菌菌劑推向市場[9]。D-29是一株從健康地膚中分離得到的枯草芽孢桿菌，目前已有研究表明其對多種植物病原真菌具有抑制作用[10,11]。本研究將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)D-29應用于采后梨褐腐病的生物防治，以探究該菌株在不同處理下對褐腐病的抑制效果，以及在果實傷口的動態變化，以便為商業化條件下果實的儲藏提供一定的依據。

1材料與方法

1.1供試菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)D-29是從健康地膚上分離的一種內生生防細菌，褐腐病原菌果生鏈核盤菌(Moniliniafructigena)分離于自然發病的梨。二者均由山西農業大學植物病理學實驗室保存。

1.2培養基

NA、NB、PDA培養基[12]。

1.3D-29處理液及病原菌孢懸液的制備

將活化后的D-29菌株接種于含30 mL NB培養液的錐形瓶中，于30 ℃ 170 r·min-1搖床培養48 h。發酵液經8 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀后用無菌水洗滌，并分別調濃度至106、107、108CFU·mL-1液備用。

挑取試管保存的褐腐病原菌菌株接種于PDA平板，于25 ℃培養7 d，收集孢子并用無菌水重懸稀釋至105spores·mL-1備用。

1.4果實的處理

選取大小及成熟度一致的健康梨果實，采用Ting等[13]的方法進行消毒處理。在超凈工作臺中使用滅菌圓木棒(φ=3 mm)在每個果實腰部人工制造一個大小約3 mm×3 mm的傷口。

第三，改變以往零散經營、松散合作的簡單團隊協作方式，通過股份合作組建大型商業企業，運行現代企業管理制度。要把眾多中小閩商或以行業、或以地域為單位聯合起來，組建大型商業企業或商貿城，用現代企業形式實現互助合作共同經營，把閩商的團隊協作納入現代企業管理，建立股權分散但經營權集中的現代企業制度，有利于參與市場競爭，又避免自相競爭。這樣，閩商團隊協作就上升到現代企業制度和企業文化的高度。這需要政府出面協調運作，從金融服務、科技中介服務、投資環境服務、公共服務等多方面入手，整合閩商力量。

1.5拮抗菌D-29最適拮抗濃度的測定

分別在果實傷口處加20 μL濃度為106、107、108CFU·mL-1的D-29菌懸液，以等量無菌水為對照(CK)，待液體晾干后再分別滴加20 μL濃度為105spores·mL-1病原菌孢懸液。對處理完成后的果實做好保濕措施，并于25 ℃下恒溫儲藏，4 d后觀察記錄果實的發病情況，并采用十字交叉法測量病斑直徑。每處理6個果實，各做3次重復，該試驗重復兩次。

果實發病率/%=每組果實發病的數量/該組果實的總數×100。

病斑擴展抑制率/%=(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑×100。

1.6接種時間對拮抗菌D-29抑菌效果的影響

該試驗分兩組，一組為先接種20 μL濃度為108CFU·mL-1的D-29菌懸液于果實傷口，分別經2、12、24 h后再接種20 μL濃度為的105spores·mL-1病原菌孢懸液；另一組為先在果實傷口上接種20 μL 105spores·mL-1病原菌孢懸液，分別經2、12、24 h后再接種20 μL濃度為108CFU·mL-1的D-29菌懸液。以無菌水為對照。儲藏方法及觀測依據同1.5。每處理6個果實，各做3次重復，該試驗重復兩次。

1.7拮抗菌D-29在果實上傷口處的動態變化測定

處理一為20 μL 108CFU·mL-1的D-29菌懸液+20 μL無菌水，處理二為20 μL 108CFU·mL-1的D-29菌懸液+20 μL 105spores·mL-1病原菌孢懸液。兩種液體滴加的時間間隔為2 h。儲藏方法同1.5。分別于0、12、24、36、48、72和96 h時隨機取樣測定菌體數量。測定方法參照Wojciech[14]等的方法。每次隨機抽取5個果實，該試驗重復3次。

1.8數據處理

采用SPSS 20.0軟件對試驗所得數據進行方差分析(P=0.05)，采用Microsoft Excel 2003軟件作圖。

2結果與分析

2.1D-29不同濃度對梨褐腐病的抑制效果

由表1可知，和無菌水對照組相比，隨著D-29濃度的增加，梨褐腐病的發病率降低，病斑擴展抑制率升高。當濃度為106CFU·mL-1和107CFU·mL-1時，果實發病率分別為53.9%、34.9%，病斑擴展抑制率分別為65.2%、76.6%；當濃度為108CFU·mL-1時，果實發病率最低，僅為4.55%，病斑擴展抑制率高達98.6%。由此可見，108CFU·mL-1D-29菌懸液的抑菌效果最佳。

2.2D-29不同接種時間對梨褐腐病的抑制效果

在接種病原菌孢懸液前2 h和12 h分別接種D-29菌懸液，果實發病率分別為4.8%、4.7%，病斑擴展抑制率分別為97.9%、98.9%，這兩個時間間隔處理下的果實發病率和病斑擴展情況之間均無明顯差異(P<0.05)。但與對照組相比，果實發病率明顯降低，且能效控制病斑的擴展；前24 h接種D-29菌懸液，可完全控制病害的發生。在接種病原菌孢懸液后2、12和24 h分別接種D-29菌懸液，果實發病率分別為35.7%、64.3%、79.4%，病斑擴展抑制率分別為88.7%、78.9%、42.7%。整體來看，在相同的時間間隔下，先接種D-29菌懸液的處理組，果實發病率明顯低于先接種病原菌孢懸液的處理組，對病斑擴展的抑制率明顯高于先接種病原菌孢懸液的處理組(P<0.05)(表2)。

表1不同濃度的D-29菌懸液對梨褐腐病的抑制效果

Table 1Inhibitory efficacy of different concentration of D-29 on brown rot of pears

D-29菌懸液濃度ConcentrationofBacillussubtilisD-29發病率/%Diseaserate病斑擴展抑制率/%InhibitionrateoflesionexpansionCK100a-1×106CFU·mL-153.9±11.1b65.2±9.1b1×107CFU·mL-134.9±4.2b76.6±3.5b1×108CFU·mL-14.55±4.7c98.6±3.9a

表2拮抗菌D-29不同接種時間對梨褐腐病的抑制效果

Table 2Inhibitory efficacy of different inoculation time of D-29 on brown rot of pears

不同的接種時間間隔IntervaltimeofinoculationofD-29andpathogen發病率/%Diseaserate病斑擴展抑制率/%InhibitionrateoflesionexpansionCK100a-D-29先于病原菌2h4.8±0.8de97.9±11.3a12h4.7±0.8de98.9±6.4a24h0e100a病原菌先于D-292h35.7±18.9cd88.7±9.6ab12h64.3±19.3bc78.9±4.8b24h79.4±10.1ab42.7±4.7c

2.3D-29在果實傷口處的數量動態結果

D-29菌體數量的動態變化如圖1所示。處理一(D-29+無菌水)菌體D-29的數量在0～12 h內迅速上升，12 h時菌體數量達為4.7×107CFU，是0 h的39倍；12～48 h呈緩慢上升趨勢；之后菌體數量穩定在5.0×108～7.9×108CFU之間。處理二(D-29+病原菌)D-29的數量在0～12 h內受病原菌的影響，數量呈小幅下降；12～48 h內菌體數量迅速上升，在48 h時高達1.04×109CFU；48～72 h呈下降趨勢；之后趨于平穩(5.4×108～6.2×108CFU)?？傮w來看，兩種處理下的D-29菌體數量均能在短時間內大量繁殖，之后趨于平穩。

圖1　D-29菌體在梨果實傷口上數量的動態變化Fig.1　Population dynamics of D-29 in the wound of pear fruit

3結論與討論

枯草芽孢桿菌能產生多種抗菌物質來抑制病原菌的生長繁殖[15～17]。本研究表明，D-29菌懸液對采后梨褐腐病有較強的抑制效果，且隨濃度的升高抑菌效果增大，這與趙妍等[18]探究枯草芽孢桿菌B10對采后草莓病害防治效果結果一致，Fan等[19]的研究也表明，隨枯草芽孢桿菌B-912濃度的增大，采后桃和油桃褐腐病的發病率及病斑擴展越小，這可能與枯草芽孢桿菌能分泌抗菌物質有關，菌體濃度越大，產生抗菌物質的濃度也相應增大，對病原菌的殺傷力也增強。

D-29與病原菌接種的先后順序及接種的時間間隔對采后梨褐腐病的發病率及對病斑擴展抑制率也有顯著的影響，先接種D-29菌懸液，抑菌效果明顯好于先接種病原菌孢懸液的處理組，且在先接種D-29菌懸液的處理組中，時間間隔為24 h時，可完全抑制病害的發生，抑菌效果最佳。Lu等[20]的研究表明，在接種病原菌前48～72 h接種拮抗菌，果實發病率及病害的嚴重程度有大幅度的下降。范青等[21]在枯草芽孢桿菌對采后柑橘青霉及綠霉病的防效試驗中表明，接種拮抗菌的48 h后再接種病原菌比24 h后接種的抑菌效果要好。這些研究均表明，越早接種拮抗菌，抑菌效果越佳，這也為實際商業化條件下采后果實的儲藏提供了依據，越早采取拮抗菌處理措施，越能有效控制病害的發生及發展。

D-29菌體在梨果實傷口上數量的動態變化測定結果表明，無論病原菌孢懸液的存在與否，D-29菌體均能在短時間內在果實傷口上定殖。Mercier等[22]認為，拮抗菌在果實傷口的快速繁殖是控制病害的關鍵因素。拮抗菌迅速繁殖，占據生存空間，攝取營養物質，不利于病原菌的生長繁殖，從而有效控制了病害的發生。

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(編輯：張貴森)

Inhibitory efficacy of postharvest brown rot in pear fruits byBacillussubtilisD-29

Wang Dan, Yao Xiaodong, Hao Xiaojuan*, Cao Hui, Li Xinfeng, Wang Jianming

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:The aim of the study was to test the inhibitory efficacy of Bacillus subtilis D-29 in control of brown rot disease of pear fruits caused by Monilinia fructigena. The inhibitory efficacy was determined by inoculating with different treatments of D-29 on the wounds of pears, and the population dynamics of D-29 in fruit wound was also determined. Results showed that D-29 could not only effectively reduce the disease rate of pear brown rot but also significantly increase the inhibition rate of disease spot enlargement; and the inhibitory ability was improving with the increasing concentration of cell suspension. The inoculation of D-29 before pathogen, disease incidence decreased obviously and inhibition rate of disease lesion expansion increased significantly. In the treatment that D-29 was inoculated in the fruit wound before pathogen, the interval time of inoculation and inhibitory efficacy had obviously positive correlation. Under the treatments both D-29+sterile water and D-29+pathogen, the population of D-29 could grow and reproduce rapidly in fruit wound.

Key words:Bacillus subtilis; Pear; Brown rot; Biological control

中圖分類號：S476.9

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)03-0182-04

基金項目：山西農業大學中青年學術骨干基金(XG201210)；中國博士后基金(個人編號：92459)；山西省科技攻關項目(20140311007-3)；2014年度山西省煤基重點科技攻關項目子項目(FT201402-12)；山西省科技基礎條件平臺建設項目(2015091004-0104)

作者簡介：王丹(1988-)，女(漢)，山西運城人，碩士研究生，研究方向：生物農藥與生物防治*通訊作者：郝曉娟，副教授，碩士生導師。Tel:0354-6288344; E-mail:xiaojuanhao@126.com

收稿日期：2015-09-19修回日期：2015-11-26