高效液相色譜—電化學法測定大鼠腦脊液中多巴胺含量的研究

黃小瑩++張黎君

摘 要：目的：研究高效液相色譜-電化學法測定大鼠腦脊液中多巴胺含量。方法：高效液相色譜運用Waters Atlantis T3作為色譜柱，且將乙腈-緩沖液（20：80）作為流動相，其pH=5.4，其相應流速則為0.32 mL·min-1。就氟哌啶醇（第一代）和利培酮（第二代）相應抗精神病藥，針對大鼠伏隔核（NAC）及前額葉皮層（mPFC）當中多巴胺釋放所具有的影響予以比較分析。結果：mPFC中多巴胺含量當給與氟哌啶醇之后，均未發生較大變化，而多巴胺在NAC當中含量則出現明顯升高狀況；當將利培酮給與之后，多巴胺含量在NAC及mPFC當中均存在明顯升高狀況。結論：高效液相色譜-電化學法穩定、靈敏及準確，對于腦微透析樣品當中相應多巴胺具體的定量分析更為適用。就第二代抗精神病藥物（利培酮）而言，其可能利用將前額葉皮層相應多巴胺水平予以升高方式，就認知功能及陰性癥狀給與改善。

關鍵詞：高效液相色譜-電化學；大鼠腦脊液；多巴胺

中圖分類號：R917 文獻標識碼：A 文章編號：1006-8937（2016）12-0068-02

多巴胺最為人體中樞神經系統當中十分重要的神經遞質，而帕金森病及精神分裂癥發病因素則為腦內多巴胺神經功能失調，為此，就準確、靈敏及快速分析方法予以建立，并對其濃度予以測定，則對藥物治療、疾病診斷及神經生理學研究均具有重要臨床意義[1]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究所選用試劑為甲酸和高氯酸、復方氯化鈉注射液、氟哌啶醇注射液、利培酮粉末、乙二胺四乙酸、無水檸檬酸、谷胱甘肽及鹽酸多巴胺等；所選用儀器為微透析探針和套管、Waters Atlantis T3色譜柱、腦立體定位儀、SCl-10A系統控制器、DGU-12A在線脫氣機、島津LC-20AD泵及手動進樣器等。所選動物為雄性大鼠，平均體重為（259±19.8）g。

1.2 方 法

將所選取相應透析樣品，經量取出相應20 μL，而后將其在存有200 μL PCR相應離心管予以放入，而后將5 μL多巴胺穩定劑加入，當完成混勻后，運用微量注射器實施取樣操作，劑量為20 μL。采用生理鹽水對氟哌啶醇注射液實施稀釋操作，且將其濃度調和至1 mg·mL-1；采用利培酮，且其中融入中性酒石酸0.1mol·L-1，實施熔解操作，而后將藥物溶液予以配置，其濃度則為1mg·mL-1。

此外，選取14只SD雄性大鼠，將其依據隨機方式劃分為三組，各為利培酮組、氟哌啶醇組及空白組。首先麻醉大鼠，并就腦區mPFC給與定位，此外，還需將NAC給與定位，而后將探針引導管埋置于腦區內，且于清醒動物裝置中將大鼠予以妥善放置，當于區間3～5 d恢復后，在大鼠皮下，將給藥管予以埋置，將插入探針及B030802均插于引導管處，在針入口處，將微量注射泵予以接入，而于出口處，則將接樣管實施接入操作，且對灌流速度予以控制，即為1.4 μL·min-1。采用Ringer's實施液灌流操作，當完成2 h平衡之后，各于30 min，將1份透析液給與收集，且基礎值則為3樣品，當完成皮下注射且給藥之后，對其中3 h樣品給與收集，并采用上述方法實施樣品檢測[2-3]。

2 結 果

2.1 線性關系考察

就多巴胺儲備液給與精密量取，而后采用高氯酸溶液 0.1 mol·L-1，將其與100 nmol·L-1實施結合稀釋操作，而后采用Ringer's液，將上述溶液分別給與0.2、0.5、2、5及20 nmol·L-1等稀釋操作，并依據上述檢測方法實施檢測。當縱坐標為測物峰面積Y，且橫坐標為待測物濃度X，則運用加權（1/X2）最小二乘法，開展回歸運算操作[4]，便可將標準曲線相應回歸方程予以得出：

Y=1.977×105X-1.401×104（r=0.9997）

而多巴胺則于0.2～20 nmol·L-1之間，具有良好的線性關系，依據信噪比S/N=3，就檢測限予以計算，則為0.05 nmol·L-1；依據S/N=10，對定量限給與計算，則為0.1 nmol·L-1。

2.2 精密度與回收率

依據上述配置方法，分別就濃度劃分為低、中及高且各為0.5、2.0及10.0nmol·L-1相應質控溶液予以配置，且需各自配置5份，其依據上述操作步驟，實施5次日內連續進樣操作，且連續3d實施日間測定，依據相應隨行標準曲線，將各個質控樣品所具有濃度予以求出，且將日間及日內相應精密度進行計算，就樣品相應回收率予以計算，見表1。

2.3 大鼠mPFC及NAC中利培酮及氟哌啶醇對其內多巴 胺釋放影響分析

依據上述操作方法，于大鼠皮下，分別將RISP及HAL各為1mg·kg-1，分別于前后順序就NAC及mPFC當中各個時間點，在具體的透析液當中所存在的多巴胺水平，所存在的相應變化率，如圖1所示。

從中可知，mPFC中多巴胺含量當給與氟哌啶醇之后，均未發生較大變化，而多巴胺在NAC當中含量則出現明顯升高狀況（1.6倍）；當將利培酮給與之后，多巴胺含量在NAC及mPFC當中均存在明顯升高狀況，及分別為后者的2.5倍及1.6倍。

3 討 論

多巴胺作為一種極性較強的物質，通常情況下，其反相色譜柱，對其具有較弱的保留行為，所以，通過對Wasters Atlantis T3色譜柱給與選擇，具有較好的分離效果。此外，在Ringer's溶液當中，多巴胺存在不穩定狀況，而在本次實驗當中，將抗氧劑加入至多巴胺 Ringer's溶液之后，對其進行觀察可知，多巴胺具有較好的穩定性。針對流動相中水相而言，其相比于有機相比例，則對于多巴胺峰位具有較為顯著的影響，伴隨水相比例相應升高狀況，則多巴胺在具體峰位方面則會出現向后移動狀況，此外，其還對雜質峰具有較小的影響。就流動相的pH而言，其也會影響于樣品峰的位置。特別是一些相應雜質峰所具有的峰位，則其具有較大的影響[5]。如若pH>4.3，則在具體的腦透析液當中，雜峰就會出現于多巴胺峰附近，對測定形成干擾。如若其值處于小于4.3或之下狀況，則該峰則會出現快速前移狀況，而多巴胺峰峰位則變化不明顯，在有效分離方面可實現。精神分裂癥的發病，往往和中腦邊緣系統當中，相應多巴胺在具體的功能方面出現紊亂，存在相關性，而對于精神分裂癥狀況下所存在的認知障礙及陰性癥狀，則和mPFC在多巴胺功能方面出現不足相關。

通過本次研究可知，利培酮（非典型抗精神病藥），對于mPFC當中多巴胺相應釋放具有明顯增加狀況，可能和其能夠對認知障礙及陰性癥狀予以改善相應機制有關，而氟哌啶醇則無法達到此功效。

參考文獻：

[1] 宋寧寧.高效液相色譜—電化學檢測法測定尿中多巴胺的含量[J].中國職業醫學，1999，（4）.

[2] 呂允鳳.應用微透析技術和高效液相色譜法測定川芎嗪對大鼠腦內多巴胺釋放量的影響[J].藥學學報，2013，（6）.

[3] 景富春，劉小莉，陳虹.HPLC-ECD法測定大鼠腦微透析液中的多巴胺及其代謝產物[J].中國臨床藥理學與治療學，2006，（9）.

[4] 張向暉，劉軍，蘇林雁.庫侖陣列電化學高效液相色譜法測定大鼠腦組織中單胺類神經遞質及代謝產物[J].醫學臨床研究，2007，（1）.

[5] 譚炳炎，鄭琳，馮翔.高效液相色譜/電化學法測定大鼠血液和腦組織中單胺類物質的含量[J].分析測試學報，2006，（2）.