復合酶法提取五味子果肉中總酚的工藝研究

張悅怡，趙　巖，蔡恩博，楊　鶴，劉雙利，張連學

(1 吉林農業大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；2 吉林人參研究院，吉林 長春 130021)

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復合酶法提取五味子果肉中總酚的工藝研究

張悅怡1,2，趙巖1，蔡恩博1，楊鶴1，劉雙利1，張連學1

(1 吉林農業大學 中藥材學院，吉林 長春 130118；2 吉林人參研究院，吉林 長春 130021)

[摘要]【目的】 采用復合酶輔助法提取五味子果肉中的總酚類物質，為五味子的綜合利用提供參考?！痉椒ā?以五味子果肉為原料，從9種生物酶中優選出果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶4種酶，在單因素(酶解時間、酶解溫度、酶解pH、酶添加量)試驗基礎上，采用正交試驗及方差分析確定復合酶法提取五味子果肉總酚的最佳條件?！窘Y果】 單因素試驗結果顯示，隨著酶解時間和pH的增加，4種酶處理五味子果肉總酚提取率總體呈先上升后下降的趨勢。隨著酶解溫度和酶添加量的增加，果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶處理五味子果肉總酚提取率呈先上升后下降趨勢，而漆酶處理總酚提取率與以上三者不同。通過正交試驗，得到五味子果肉總酚提取的最佳條件為添加 1.0% 果膠酶、3.0%纖維素酶、3.0%中性蛋白酶、5.0%漆酶(以上均為質量分數)，pH 5.0，酶解時間20 min，溫度30 ℃，在此條件下五味子果肉總酚的提取率為2.83%，高于單酶處理總酚提取率，是無酶工藝(1.19%)的2.38倍?！窘Y論】 得到的復合酶輔助提取法能夠明顯提高五味子果肉總酚提取率，且工藝簡單，可用于規?；a。

[關鍵詞]五味子果肉；復合酶；總酚；提取

五味子為木蘭科植物五味子(Schisandrachinenise(Turcz.) Baill)的干燥成熟果實，俗稱北五味子，其味酸甘、性溫，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心等功效[1]?，F代藥理研究表明，五味子有保肝益腎、保護心腦血管、鎮痛、鎮靜、催眠、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和增強免疫等作用[2-3]。五味子作為一種新型的“藥食同源”功能性保健食品，其果實已成為新興食品工業的一種重要原料。近年來，市場上有多種五味子產品問世，如五味子保健飲料、果醋、果酒等[4-6]。這些產品的生產均以五味子鮮果為原料，隨著人們對保健食品的認可度不斷提高，市場上對五味子的需求量逐年劇增，使得加工過程中產生了大量五味子果渣，這些果渣均被遺棄而未能充分利用，對環境也造成了嚴重影響[7]。

大量研究證明，五味子中含有多種生物活性成分，如木脂素、酚類成分、氨基酸、維生素等[8]，而多酚物質具有廣泛的生物活性， 包括抗氧化、抗輻射、清除自由基、抗突變、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、舒張血管、抗菌等作用[9-11]。因此，充分利用五味子加工果渣具有廣闊的發展前景。

生物酶作為一種特殊的以蛋白質形式存在的生物催化劑，在啤酒、果汁果酒、紡織、飼料、皮革、酒精生產等行業均得到了廣泛應用，更以其特異、高效、綠色環保等特點而備受青睞。目前，對五味子多糖的提取研究主要是用單酶方法[12]，其原理是利用酶對細胞壁及細胞質中大分子的降解，促使植物有效成分釋放；該方法反應條件溫和，是一種高效、環保的植物有效成分提取技術[13-15]，提取條件溫和、能耗低、無污染[16]。因此，本研究將果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶按科學的配比制成復合酶，對原料五味子果肉進行預處理，將五味子種子與果肉分離，分析復合酶提取條件下五味子果肉酚類成分的提取率，以期為五味子的綜合應用提供參考。

1材料與方法

1.1材料

五味子購于當地藥材市場，經吉林農業大學張連學教授鑒定為木蘭科植物五味子(Schisandrachinenise(Turcz.) Baill)的成熟果實，將果肉和種子分離，陰干，分別粉碎，備用。

1.2試劑與儀器

主要試劑有：沒食子酸，北京百靈威科技有限公司生產；福林酚試劑，合肥博美生物生產；中溫淀粉酶(3 000 U/g)、中性蛋白酶(20 萬U/g)、α-淀粉酶(1 萬U/g)、木瓜蛋白酶(200 萬U/g)、纖維素酶(26 萬U/g)、甘露聚糖酶(20 萬U/g)、果膠酶(4 萬U/g)、木聚糖酶(30 萬U/g)、漆酶(2 萬U/g)，由蘇州昆藍生物科技有限公司提供。其他試劑均為分析純。

主要儀器包括：港威超聲儀(江蘇省張家港市港威超聲電子有限公司)、流水式中藥粉碎機(中國浙江溫嶺市大海藥材器械廠)、百靈LA114型電子天平(常熟市百靈天平儀器有限公司)、UV-754紫外可見分光光度計(山東高密彩虹分析儀器有限公司)、HH-W-600型數顯恒溫水箱(金壇市江南儀器廠)。

1.3方法

1.3.1單酶優選試驗精密稱取五味子果肉0.25 g，置于100 mL三角瓶中，分別加入中溫淀粉酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶、甘露聚糖酶、果膠酶、木聚糖酶、漆酶9種生物酶，在酶解溫度為50 ℃、pH 6.0條件下酶解30 min，以總酚提取率為指標，以無酶樣品作為對照，優選作用較強的4種單酶，進行單因素試驗。

1.3.2單因素試驗根據預試驗結果，以酶解時間、酶解溫度、酶解pH以及酶添加量進行單因素試驗，分別考察以上4個因素對總酚提取率的影響。

(1)酶解時間對總酚提取率的影響。在酶解溫度50 ℃、pH=6.0、酶添加量均為1%(質量分數，下同)條件下，考察果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶不同酶解時間(0，10，20，30，60 min)對總酚提取率的影響。

(2)酶解溫度對總酚提取率的影響。在酶解時間為20 min、pH=6.0，酶添加酶量均為1%條件下，考察果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶在不同酶解溫度(30，40，50，60 ℃)對總酚提取率的影響。

(3)酶解pH對總酚提取率的影響。在果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶酶解溫度分別為40，40，50，30 ℃，酶解時間為20 min，酶添加量均為1%的條件下，考察酶解pH(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0)對總酚提取率的影響。

(4)酶添加量對總酚提取率的影響。在果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶酶解溫度分別為40，40，50和30 ℃，pH分別為5.0，5.0，4.0，5.0，酶解時間均為20 min條件下，考察不同酶添加量(0，0.5%，1.0%，3.0%和5.0%，均為質量分數)對總酚提取率的影響。

1.3.3多因素正交試驗在單因素試驗的基礎上，為了優化提取工藝，選取果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶、漆酶添加量以及pH、酶解時間、酶解溫度7個因素，設計L8(27)正交試驗，確定復合酶法提取五味子果肉總酚的最佳條件，優化提取工藝，試驗重復3次，結果取平均值。

表 1　五味子果肉總酚提取工藝的L8(27)正交試驗設計中的因素與水平

1.3.4總酚提取率的測定采用比色法測定五味子果肉中的總酚含量：精密吸取樣品溶液0.5 mL，置于25 mL量瓶中，加入福林酚試劑2.5 mL、碳酸鈉溶液(75 g/L)2 mL，于50 ℃水浴加熱5 min，冷卻后用蒸餾水定容，然后在760 nm測定供試品質量濃度。提取率采用外標一點法[17]進行計算，公式如下：

式中：ρ供試品質量濃度(mg/mL)，v為供試品體積(μL)，D為稀釋倍數，m為供試品的質量(g)。

2結果與分析

2.1五味子果肉總酚提取生物酶的優選

由圖1可知，與無酶處理(對照)相比，9種酶對五味子果肉總酚提取率均有不同程度的提升作用，并以果膠酶、纖維素酶、中性蛋白酶和漆酶4種酶效果較好，故選擇該4種酶作為五味子果肉總酚提取用生物酶。

圖 1　9種酶對五味子果肉總酚提取率的影響

2.2五味子果肉總酚提取的單因素試驗結果

2.2.1酶解時間酶解時間對五味子果肉總酚提取率的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著酶解時間的延長，總酚提取率也不斷上升，至20 min時4種酶處理的五味子總酚提取率達到最大值；此后總酚提取率隨著時間的延長而下降?？芍附鈺r間以20 min為宜。

2.2.2酶解溫度酶解溫度對五味子果肉總酚得率的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著溫度的升高，果膠酶、纖維素酶和漆酶處理五味子果肉總酚提取率都逐漸增大，分別在40，40和50 ℃達到最高值，之后隨溫度的繼續升高總酚提取率均降低；在30～60 ℃時，漆酶處理五味子果肉總酚提取率隨著酶解溫度的升高而下降，因此在30 ℃時，其總酚提取率最高。

圖 2　酶解時間對五味子果肉總酚提取率的影響

2.2.3酶解pHpH值對五味子果肉總酚提取率的影響如圖4所示。由圖4可知，在pH為3.0～7.0 時，隨pH升高，4種酶處理五味子果肉總酚提取率均呈先升后降趨勢，其中中性蛋白酶在pH為4.0時，總酚提取率達到最高；果膠酶、纖維素酶、漆酶均在pH為5.0的弱酸性條件下有較好的酶解效果，此時總酚提取率均較高。

2.2.4酶添加量酶添加量對五味子果肉總酚提取率的影響如圖5所示。由圖5可知，添加酶后樣品總酚提取率比無酶樣品均有明顯增加，且隨著酶添加量的增加，果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶均在添加量為1.0%時總酚提取率達到最高；隨著添加量的增加，漆酶處理五味子果肉總酚提取率持續升高，在本試驗條件下，當其添加量為5.0%時，總酚提取率達到最高。

圖 4　酶解pH值對五味子果肉總酚提取率的影響

2.3五味子果肉總酚提取多因素正交試驗的結果

由表2和表3可以看出，各因素對五味子果肉總酚提取率影響的大小依次為果膠酶添加量、中性蛋白酶添加量、酶解時間、纖維素酶添加量、pH值、酶解溫度、漆酶。綜合考慮原輔料成本及能耗等因素，確定復合酶法提取五味子果肉的最佳工藝條件為，A1B2C2D2E2F1G1，即果膠酶添加量1.0%，纖維素酶添加量3.0%，中性蛋白酶添加量3.0%，漆酶添加量5.0%，pH 5.0，酶解時間20 min，溫度30 ℃。進一步開展驗證試驗，在此條件下五味子果肉總酚提取率為2.83%，是無酶工藝(1.19%)的2.38倍。

表 2　五味子果肉總酚提取工藝優化的L8(27)正交試驗結果

表 3　五味子果肉總酚提取工藝優化正交試驗結果的方差分析

3結論

本試驗采用復合酶輔助提取法對五味子果肉中酚類成分的提取工藝進行了優化，使五味子果肉中的總酚提取率得到了大幅度的提高。通過正交試驗，得出復合酶輔助提取法的最佳工藝參數為：果膠酶添加量1.0%，纖維素酶添加量3.0%，中性蛋白酶添加量3.0%，漆酶添加量5.0%，pH 5.0，酶解時間20 min，溫度30 ℃。五味子果肉主要成分為多酚類，該工藝中的中性蛋白酶能夠高效水解蛋白質，漆酶能夠催化木質素類成分降解，纖維素酶能夠催化水解纖維素，而果膠酶具有針對果膠的解酯、水解、破裂作用，在本研究最佳提取條件下，五味子果肉總酚提取率為2.83%，是無酶工藝(1.19%)的2.38倍。因此4種酶相互作用，使五味子果肉總酚提取率高于單一酶作用效果，更高于無酶工藝，基于酚類的顯著作用，其大量、高效率生產為五味子新產品(食品、藥品、保健食品)的研究與開發奠定了基礎。

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Extraction technology of total phenol from flesh ofSchisandrachinensisby compound enzymatic hydrolysis

ZHANG Yue-yi1,2,ZHAO Yan1,CAI En-bo1,YANG He1,LIU Shuang-li1,ZHANG Lian-xue1

(1CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2JilinGinsengInstitute,Changchun,Jilin130021,China)

Abstract:【Objective】 The total phenol was extracted of Schisandra chinenise (Turcz.) Baill flesh by compound enzyme hydrolysis method to improve the utilization of Schisandra.【Method】 Pectinase,cellulose,neutral protease and laccase were selected from 9 enzymes and orthogonal experiments and variance analyses were conducted to determine the optimum conditions for phenol extraction based on tests of single factor (hydrolysis time,hydrolysis temperature,pH,enzyme dosage).【Result】 With the increase of hydrolysis time and pH,treatment of Schisandra fruit with the selected 4 enzymes increased the total phenol extraction yield first but decreased subsquently.As the increase of hydrolysis temperature and enzyme dosage,treatment of Schisandra fruit by pectinase,cellulose,and neutral protease increased total phenol extraction yield first and decreased subsquently,while total phenol extraction yield after laccase treatment was different from the other three.The optimum conditions were:pectinase 1.0%,cellulose 3.0%,neutral protease 3.0%,laccase 5.0 %,pH 5.0,time 20 min,and temperature 30 ℃.Under the optimal conditions,the yield of total phenol was 2.83%,which was 2.38 timers of that of the traditional process (1.19%). 【Conclusion】 Enzyme-assisted method was efficient and time-saving with simple operation and good stability.It can be used for industrial production.

Key words:Schisandra chinensis fruits;compound enzymes;total phenol;extraction

DOI：網絡出版時間:2016-01-0810:2210.13207/j.cnki.jnwafu.2016.02.026

[收稿日期]2014-07-09

[基金項目]國家公益性行業科研專項(201303111)；吉林省科技發展計劃項目(20140204013YY,20150307012YY)

[作者簡介]張悅怡(1990-)，女，吉林長春人，碩士，主要從事天然藥物化學成分與生物活性研究。

[通信作者]趙巖(1979-)，男，吉林長春人，副教授，博士，主要從事天然藥物化學成分與生物活性研究。

[中圖分類號]Q949.95；S567

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)02-0187-06

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