自制組織微陣列儀及其在肝癌分子病理研究中的應用

袁玲，董福祿，季，陸錦標，陳苗苗，季菊玲，王愛婷，鄂群,Δ

(1.江蘇省靖江人民醫院 內科，江蘇 靖江 214500；2.南通大學醫學院 基礎醫學研究室，江蘇 南通 226001；3.江蘇省靖江人民醫院 普外科，江蘇 靖江 214500；4.南通大學醫學院 病理學系，江蘇 南通 226001)

自制組織微陣列儀及其在肝癌分子病理研究中的應用

袁玲1，董福祿2，季3，陸錦標4，陳苗苗2，季菊玲4，王愛婷2，鄂群2,4Δ

(1.江蘇省靖江人民醫院 內科，江蘇 靖江 214500；2.南通大學醫學院 基礎醫學研究室，江蘇 南通 226001；3.江蘇省靖江人民醫院 普外科，江蘇 靖江 214500；4.南通大學醫學院 病理學系，江蘇 南通 226001)

目的 自主研發制備一種新型的結構合理、使用方便的石蠟組織微陣列手動裝置，以解決現有的石蠟組織芯片工具由于結構、組合等原因在實驗、研究工作中存在使用不便等問題。方法 自主研發制備石蠟組織微陣列手動裝置，并利用此裝置將62例肝癌組織及匹配的癌旁組織標本制備組織芯片，并對其進行HE染色及AFP、CD34、Ki67和HIF alpha等蛋白質的免疫組織化學實驗，分析肝癌組織及癌旁組織的表達差異性。結果 對自制組織芯片進行多種蛋白的免疫組織化學檢測和分子病理分析結果顯示，染色清晰完整；統計分析顯示，Ki67和HIF alpha在肝癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織(P=0.0003，P=0.0144)，與文獻的報道一致。結論 本文自制組織微陣列儀具有較高的實用價值，是生物化學藥物分子機制和病理研究應用的有效工具。

組織微陣列儀；組織芯片；肝癌；免疫組織化學

組織芯片(tissue chip，TC),又稱組織微陣列( tissue microarray, TMA)[1], 是將數十、數百個乃至上千個小的組織標本按照一定的規律有序排列在某一個固相載體上而成，其目的是為了研究同一種基因或同一種蛋白質分子在不同的組織或細胞中的表達狀況。具有體積小、高通量、大樣本、高效率、誤差小,可實現自動化和微型化及可與其他生物技術相結合的特點[2]。組織芯片是由Barrifora等[3]在1986年最早提出的；其后，Kononen等[4]于1998年在 Nature Medicine雜志發表組織芯片論文，并首次成功運用組織芯片技術研究6種基因在乳腺癌組織中的表達情況，證實了該技術的實用價值，并宣告組織芯片概念的誕生。在如今的生物醫學研究中，組織芯片技術已經在癌癥研究中廣泛應用，是生物化學藥物分子機制和病理研究應用的有效工具[5-8]?，F有的石蠟組織芯片工具，由于結構、組合等原因，在實驗、研究工作中存在使用不便等問題，為了改善這些不便之處，本實驗利用自制組織微陣列儀制作肝癌及癌旁樣本組織芯片,并對多種蛋白質的表達進行免疫組織化學分子病理研究。

1 材料與方法

1.1 樣本 本實驗所用石蠟標本取自2000年～2010年在江蘇省南通地區多家醫院接受肝細胞肝癌手術切除的患者62例?；颊呷脒x標準包括:①原發性肝癌并采用根治性手術切除；②病理確診為肝細胞肝癌；③術前未接受任何相關抗腫瘤治療。

1.2 方法

1.2.1 通用組織微陣列儀制備[9]:石蠟組織微陣列手動裝置包括；石蠟組織微陣列定位版和實驗支架；芯棒；取樣針；熔合板；多功能框和芯片種植平面檢測板。石蠟組織微陣列定位板與實驗支架活動式安裝匹配，上述部件放置于一個盒體中，所述實驗支架為C型軌道型金屬件。

石蠟組織微陣列定位版周邊標記有自然數字及相對應的英文字母，用作對呈正三角形陣列和正方形陣列排列孔陣列中的孔進行二維定位；石蠟組織微陣列定位版的另一面標有“石蠟組織微陣列定位板”等字樣。版的兩側中央有U 型凹槽，是實驗支架的嵌入固定部位；一側版面的四角有缺口式入槽口。

芯棒為粗段短而細段長的形式，粗段與細段的長度比例為1:5～1:6，細段不銹鋼圓柱體Φ <石蠟組織微陣列定位版上的孔徑；粗段不銹鋼圓柱體長約為4～6 mm，其Φ >石蠟組織微陣列定位版上的孔徑；芯棒的細段插入石蠟組織微陣列定位版上的孔，組成芯棒陣列(芯棒的細段和粗段)；芯棒一體兩端的圓柱體段均可為鑄造受體石蠟芯片芯穴的部位。另設有多功能框及與其匹配在恒溫室進行熔合操作的熔合板。

取樣針為兩用雙鉆頭取樣針：為一根有銅套的不銹鋼毛細管，其兩端管口呈圓周鋸齒狀或刀刃樣銳口，可用于對石蠟組織塊和人體或動物組織的固定標本進行取樣；管口呈齒形相似大小一致的圓周鋸齒口，有4～7個鋸齒狀凸；或銳利刀刃樣的管口；是鉆取石蠟組織和人體或動物等生物組織樣品的關鍵部位；取樣針不銹鋼毛細管體外有固定聯體的銅套管，其表面有波浪樣凸凹紋理，是旋轉取樣針進行取樣的手持工作面；銅套管表面一端有間隙疏密有致的粗細淺凹槽，是與取樣針柄的圓端平面Φ 標識有相同意義的特定標識。讀數從銅套端第一粗凹起；有細凹槽時，讀數以細凹槽為準，精確到0.1 mm；無細凹槽時，則以粗凹槽為準，讀數精確到1 mm。粗凹槽間距10 mm，粗凹數量代表毫米數量單位；細凹位于兩粗凹間，代表0.1毫米數量單位，其位于兩粗凹間的位置代表0.1毫米倍數的讀數精確單位。如；粗凹槽(僅有)2條時，讀數為Φ=2 mm；共有3條粗凹槽標識時，并有細凹槽位于第二與第三條粗凹槽的(中央)1/2處，此時讀數Φ=2.5 mm；取樣針芯桿匹配于取樣針管內，為用于輔助取樣針管推出供體樣本石蠟芯的不銹鋼圓柱體。一端為針尖，是推出樣本石蠟芯的部位。另一端為銅柄，銅柄端的圓平面有Φ和數字標識(與銅套管表面的凹槽代表的Φ讀數相同)；從針芯尖起與不銹鋼取樣針管等長的針芯桿表面位置起始(向針尖方)，有10條窄凹痕，間隔/窄凹痕=1 mm，為取樣時取樣深度的度量標識；在針芯桿銅柄端與針芯桿的連接口嵌有嵌有環形的橡膠樣墊圈，其Φ ≥取樣針管口，起保護取樣針管口的作用。

熔合板，為一塊薄的金屬材料板，承置安放多功能框，是石蠟組織微陣列芯片坯在恒溫臺或恒溫室進行熔合操作的中介平臺。

多功能框，為一呈距形的無底不銹鋼金屬框，框分成上口部與下口部，上口部內側的四周邊有與通用型組織包埋盒吻合的直角凹，是支架安置通用型組織包埋盒的接口和進行石蠟組織微陣列芯片包埋的區域；下口部的四周壁呈斜坡梯形，其底口與熔合板和檢測板接合匹配使用，是執行石蠟組織微陣列芯片空穴坯的鑄模、芯片的種植、芯片切片面的觀測校正和芯片熔合的區域。

芯片種植平面檢測板，是一種透明非金屬材料板，襯托于多功能框下口部匹配使用時，可檢測芯片種植質量，即；所有已種植的芯片是否到達同一平面(亦稱切片平面)。

1.2.2 通用組織微陣列儀制備組織芯片流程:通用組織微陣列儀制備組織芯片流程見圖1。

圖1 通用組織微陣列儀制備組織芯片流程Fig.1 Process of general tissue microarray instrument for preparing tissue microarray

制備空穴微陣列模塊：①將微組織陣列定位版插入實驗支架；②在定位版表面敷設薄紙，按預設陣列插入芯棒；③加熱芯棒陣列(用芯片儀熔合包埋組合件的暖風機)；④用鑄?？蚩蜃⌒景絷嚵?；⑤將芯棒陣列置于石蠟組織芯片制備機流蠟咀下灌注石蠟；⑥待石蠟冷凝后，去除浮蠟并退出芯棒；⑦充分冷卻后退出空穴微陣列模塊，修整后待用。

取樣與種植：①將待用供體石蠟組織塊37 ℃～42 ℃預熱；②用取樣針鉆取樣品；并種植于微陣列模塊空穴(23 ℃～4 ℃，可在冷凍臺上進行)；③將種植完畢的芯片模塊移置到透明檢測板上待修整。

檢查及調整空穴中芯片陣列(芯片熔合前處理)：①透過檢測板觀察并調整芯片至同一水平面(可提高得片率)；②將芯片模塊移置到芯片熔合板上，再平放到芯片熔合室中進行芯片熔合。

芯片熔合與包埋(涉及芯片儀熔合包埋組合件熔合室冷凍臺和流蠟包埋功能)：①(30 min左右)密切觀察至芯穴中蠟芯溶融而芯穴/管壁不溶(為最佳)時中止熔合；②小心平穩取出微陣列芯片模塊待石蠟冷凝；③待芯穴中蠟芯完全凝固后，即加蓋包埋盒并快速灌注包埋石蠟；④移出充分冷卻后，即退出石蠟組織芯片塊并修整待用。

1.2.3 免疫組織化學染色步驟:石蠟切片脫蠟,酒精梯度水化；用PBS沖洗3次，每次3 min；pH6.0檸檬酸緩沖液熱修復10～15 min；3%過氧化氫室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性；PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，滴加第一抗體(AFP，兔多克隆抗體，1:100倍稀釋；CD43，鼠單克隆抗體，1:100倍稀釋；HIF-1，鼠單克隆抗體，1:100倍稀釋；KI67，鼠單克隆抗體，1:100倍稀釋)，室溫下孵育60 min后4 ℃過夜；PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，每張切片加1滴或50 uL酶標廣譜第二抗體，室溫下孵育10～15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。除去PBS液，滴加新鮮配制的DAB溶液(酶底物顯色劑)，顯微鏡下觀察；自來水沖洗，蒸餾水洗后蘇木素復染；自來水沖洗，0.3%鹽酸酒精分化；自來水沖洗返藍；切片經過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.4 結果判定:根據空白、陽性和陰性對照的顯色情況，在確定無假陽性和假陰性的前提下，以細胞膜或細胞漿染成棕黃及棕褐色為陽性。將按照其染色強度判為：無著色(0分)，淺黃(1分)，棕黃(2分)及棕褐色(3分)；按照陽性信號比例判為：陰性(0分)，1%～24%(1分)，25%～49%(2分)，50%～74%(3分) 75%～100%(4分)?？傮w評分值為染色強度×陽性信號比例。

1.3 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件進行數據處理,2組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌手術標本組織芯片制備質量和普通HE染色病理分型 本次實驗共成功制備肝癌組織芯片1枚，其中包含62例肝癌組織及其癌旁組織和2列正常肝臟組織標本。組織芯片經過切片后仍然排列整齊，層次分明，厚薄均勻，對比明顯，未出現漂移，且芯片具有較好的完整性,見圖2。

圖2 肝癌組織芯片HE染色Fig.2 HE staining for hepatocellular carcinoma tissue microarray

2.2 肝癌手術標本組織芯片免疫組化染色 利用構建的組織芯片,首先檢測了 AFP和CD34兩種蛋白在肝癌及其癌旁組織中的表達情況。鏡下對2種蛋白染色觀察可見，陽性信號清晰可辨，染色定位于細胞膜及細胞質，且AFP和CD34在肝癌的腫瘤組織中均有廣泛表達,見圖3?？梢?，通過自制組織微陣列儀制作的組織芯片可以高通量得到完整清晰的免疫組織化學結果。

圖3 肝癌組織芯片AFP和CD34免疫組化染色結果Fig.3 Immunohistochemical staining of AFP and CD34 in tissue microarray of hepatocellular carcinoma

2.3 肝癌手術標本組織芯片免疫組化染色結果分析 利用自主制備的肝癌組織芯片，對細胞增殖指標Ki67和細胞缺氧指標HIF alpha進行了免疫組化檢測，并且對62例實驗結果進行統計分析。統計結果顯示，細胞增殖指標Ki67和細胞缺氧指標HIF alpha在肝癌組織中的表達都顯著高于癌旁組織(P=0.0003，P=0.0144)，見圖4。

圖4 肝癌及癌旁組織芯片Ki67和HIF alpha免疫組織化學染色結果統計T: 肝癌組織, NT: 癌旁組織Fig.4 Statistical analysis of immunohistochemical staining of AFP and CD34 in tissue microarray of hepatocellular carcinoma and adjacent tissuesT: HCC tumor tissues; NT: HCC adjacent tissues

3 討論

組織芯片的原理是：將采集的幾十到上千個的圓柱形小組織樣本整齊的排放到另一個空白蠟塊中制成組織芯片蠟塊。然后對其進行切片；再將切片轉移到載玻片上而制成組織芯片。之后，用制好的組織芯片可進行HE染色、組織化學、熒光原位雜交、免疫組織化學等一系列檢測。組織芯片是將基因、蛋白表達水平檢測與組織形態學有機地結合起來，克服了傳統分子病理學技術和病理組織學技術操作復雜、工作效率低等缺點，可同時對幾十甚至幾百個樣品同時進行檢測，大大提高了工作效率[10-11]?，F有的石蠟組織芯片工具，由于結構、組合等原因，在實驗、研究工作中存在使用不便等問題。我們自主研發了一種石蠟組織微陣列手動裝置，包括；多功能框、石蠟組織微陣列定位板、實驗支架、芯棒、取樣針，熔合板和芯片種植平面檢測板，其中石蠟組織微陣列定位版與支架活動式安裝匹配。

為了證實自主研發石蠟組織微陣列手動裝置的有效性及準確性，我們使用自制的肝癌及癌旁組織芯片對Ki67，HIFalpha，NF-κB和p65等多種蛋白進行免疫組織化學分析，并對部分結果進行統計。Ki67是一種在增殖細胞中表達的核蛋白，與細胞的周期密切相關，覆蓋于除G0期外的各細胞周期，其表達水平反映了腫瘤細胞的增殖狀況[12]。本實驗結果與之前報道實驗結果相似[13-14]：在肝癌組織芯片樣品中，Ki67免疫組化指數顯著高于癌旁組織芯片樣品組，說明肝癌的發生發展需要細胞的大量增殖。而腫瘤細胞的快速增殖，必然需要消耗大量的能量和氧氣，進而導致腫瘤細胞處于缺氧狀態中，而低氧誘導因子HIF alpha是腫瘤在低氧環境下調控的關鍵因子，所以我們對HIF alpha的表達水平進行了免疫組織化學檢測。與大量研究報道一致[15-16]，本實驗結果顯示在肝癌組織芯片樣品中HIF alpha的表達水平顯著高于癌旁組織，說明肝癌組織需要上調HIF alpha的表達水平來適應低氧環境。

綜上所述，本文利用自主設計的石蠟組織微陣列手動裝置成功制備肝癌及癌旁組織芯片。對自制組織芯片進行多種蛋白的免疫組織化學檢測和分子病理分析，染色結果清晰完整，并且對結果進行統計分析發現與大量報道具有高度的一致性，說明自制組織微陣列儀具有較高的實用價值，是生物化學藥物分子機制和病理研究應用的有效工具。

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(編校：吳茜)

Self-developed tissue microarray instrument and its application in hepatocellular carcinoma

YUAN Ling1?, DING Fu-lu2?, JI Yong3, LU Jin-biao4, CHEN Miao-miao2, JI Ju-ling4, WANG Ai-ting2, E Qun2,4Δ

(1.Department of Medicine, Jingjiang People’s Hospital, Jingjiang 214500, China; 2.Center for Basic Medical Research, Nantong University School of Medicine, Nantong 226001 China; 3.Department of Surgery, Jingjiang People’s Hospital，Jingjiang 214500, China; 4.Department of Pathology, Nantong University School of Medicine, Nantong 226001, China)

ObjectiveTo make a novel paraffin wax tissue microarray manual device with reasonable structure and handy function，and resolve the inconvenience showed in the usages of existing paraffin tissue microarray tools due to its unreasonable structure, combination and so on in the research work.MethodsA novel paraffin wax tissue microarray manual device was made, and 62 cases of hepatocellular carcinoma (HCC) and adjacent tissue array was prepared, then the tissue array was stained by H&E, also AFP, CD34, Ki67 and HIF alpha by immunohistochemistry.ResultsThe HCC and adjacent tissue microarray was successfully prepared by self-developed paraffin tissue microarray device. The result of staining is very clear and convenient for molecular pathology analysis. Statistical analysis showed that Ki67 and HIF alpha expression in HCC tissues was significantly higher than that in adjacent tissues (P=0.0003,P=0.0144), consistent with reports.ConclusionThis self-developed tissue microarray manual device with high practical value is an effective tool for the study of the molecular mechanism of biochemical drugs and pathology.

tissue microarrays; tissue microarray instruments; Hepatocellular carcinoma; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.006

袁玲，女，碩士，副主任醫師，研究方向：病毒性肝炎，E-mail：1015726785@qq.com;董福祿，共同第一作者，男，講師，博士，研究方向：腫瘤生物學，E-mail：dongfulu@ntu.edu.cn；鄂群，通信作者，男，本科，高級實驗師，研究方向：腫瘤病理，E-mail：nestle@ntu.edu.cn。

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