白花蛇舌草對Renca腎癌細胞模型小鼠凋亡相關蛋白Fas、caspase3及caspase7表達影響

周進，趙朋

(天津市南開醫院 泌尿外科，天津 300100)

白花蛇舌草對Renca腎癌細胞模型小鼠凋亡相關蛋白Fas、caspase3及caspase7表達影響

周進Δ，趙朋

(天津市南開醫院 泌尿外科，天津 300100)

目的 探討中藥白花蛇舌草對Renca腎癌細胞模型小鼠凋亡相關蛋白Fas、caspase3及caspase7表達的影響。方法 選取BALB/C小鼠120只，隨機分為正常對照組、模型對照組、白細胞介素組、白花蛇舌草組，各30只，雌雄各半。除正常對照組外，各組均建立腎癌模型，并給予相應的藥物治療。觀察所有小鼠的腫瘤體積及重量、抑瘤率，對Fas、FasL、caspase3及caspase7蛋白表達水平進行檢測。結果 與模型對照組比較，白花蛇舌草組、白細胞介素組小鼠的腫瘤體積、瘤體重量較低，抑瘤率較高，Fas陽性表達率及Fas蛋白表達較高，FasL陽性表達率及FasL蛋白表達較低，caspase3、caspase7陽性表達率及蛋白表達水平較高，差異均有統計學意義(P<0.05)。其中白花蛇舌草組以上指標均優于白細胞介素組(P<0.05)。結論 白花蛇舌草能夠明顯促進腎癌模型小鼠凋亡相關蛋白Fas、caspase3及caspase7表達，抑制FasL蛋白表達，提高抑瘤率。

白花蛇舌草；腎癌；小鼠；細胞凋亡相關蛋白；Fas；caspase

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)簡稱腎癌，是腎實質泌尿小管上皮系統來源的惡性腫瘤，發病率在泌尿生殖系統中居于第2位[1]，占全身惡性腫瘤的2～3%，每年約有10萬余例患者死于該病[2]。近年來，腎癌發病率呈逐漸上升趨勢[3]，全世界增長速度約為每年2%。根治性手術是治療早期腎癌的有效手段，腎癌以腰痛和血尿為常見癥狀，但發病早期不明顯，約有50～60%以上的患者并無明顯癥狀，一旦發現已失去手術時機，而且即使手術，術后有20～40%的可能會復發轉移。腎癌對于放療、化療均不敏感，免疫治療及靶向治療雖可以一定程度上延長生存期[4]，無法在臨床上廣泛使用。中藥在腫瘤治療中的應用日益受到關注。白花蛇舌草為茜草科草本植物，是常用抗腫瘤中藥之一，具有清熱解毒、消痛散結的作用，有研究顯示，白花蛇舌草能誘導多種腫瘤細胞凋亡[5]，關于其治療腎癌的相關研究較少。本研究即探討中藥白花蛇舌草對腎癌模型小鼠凋亡相關蛋白Fas、caspase3及caspase7表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：選取SPF級8周齡健康成年BALB/C小鼠(由武漢大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(鄂)2013-0004)120只，體質量(26.47±3.82)g。將鼠箱內溫度設置為(18～22) ℃，濕度設置為50～60%，飼以標準飼料(包含20～50%蛋白質，5～10%粗脂肪，3～5%粗纖維)及充足的飲水，自由活動與進食，空氣流通，保持安靜、溫暖、晝夜節律適合的飼養環境，適應性飼養1周。實驗過程遵循《實驗動物保護條例》相關規定。

1.1.2 藥品與試劑：白花蛇舌草，購自天津市南開醫院藥房(經天津市南開醫院中藥鑒定教研室鑒定)，加水、煮沸、濃縮至1 g生藥/mL；BALB/C小鼠來源的腎癌細胞(Renca)，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；重組人白細胞介素-2(125ALa)注射劑，規格：每支20萬IU，批號：S20150120，北京雙鶴藥業股份有限公司；RPMI1640培養基，購自上海博升生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，上海碧云天生物技術有限公司產品；Fas、FasL、caspase3、caspase7兔多克隆抗體，購自上海瑞齊生物技術有限公司；羊抗兔IgG-辣根過氧化酶(HRP)標記二抗，南京生興生物技術有限公司產品；二氨基聯苯胺(DAB)顯色液、蘇木素伊紅染色液，購自上海鼎杰生物科技有限公司。

1.1.3 儀器：HSP-300-智能恒溫恒濕培養箱，江蘇省金壇市友聯儀器研究所產品；DST673實驗動物稱量用電子秤，蘇州市蘇杭科技器材有限公司產品；500-774數顯卡尺，日本三豐Mitutoyo公司產品；GE-100凝膠電泳儀，上海譜振生物科技有限公司產品；Tanon-1600凝膠圖像處理系統，購自IDE上海天能科技有限公司產品；Eppendorf 5427 R臺式高速冷凍離心機，Eppendorf艾本德中國有限公司產品；CX23光學顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社產品。

1.2 方法

1.2.1 白花蛇舌草水煎液的制備：稱取白花蛇舌草200 g，研磨成粗粉，加入2 000 mL水浸泡30 min，大火煮沸，文火保持微沸2 h，過濾除菌后，于剩下藥渣中加入2 000 mL水，繼續煎煮，方法與第一次相同，經紗布過濾除菌后合并2次濾液，濃縮成1 g生藥/mL的藥液，加適量蒸餾水配制濃度為的6 mg/mL白花蛇舌草溶液。

1.2.2 造模及實驗方法[6]：經適應性飼養后，將120只小鼠按照隨機數字表法分為正常對照組、模型對照組、白細胞介素組、白花蛇舌草組共4組，每組各30只，雌雄各半。制備Renca細胞懸液：取出Renca細胞，置于RPMI 1640培養液(含10%胎牛血清+100 U/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素)中，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h，待細胞貼壁生長良好，取對數生長期的細胞進行擴增，達到所需細胞數后，收獲細胞，清洗后加入適量PBS，配制Renca細胞懸液，濃度為1×107個/mL；接種小鼠：對模型對照組、白細胞介素組、白花蛇舌草組小鼠左腋下皮膚進行消毒，取0.25 mL Renca細胞懸液，進行皮下接種，之后繼續正常飼養小鼠，密切觀察腫瘤生長情況，2周后，于左腋下觸及直徑約為5 mm的腫瘤結節，即為造模成功，本實驗中各組均成功建立小鼠腎癌模型。模型成功建立后，正常對照組及模型對照組給予0.9%NaCl溶液0.2 mL，1次/天，灌胃；白細胞介素組給予重組人白細胞介素-2(125ALa)注射劑0.2 mL，1次/天，腹腔注射；白花蛇舌草組給予6 mg/mL白花蛇舌草溶液0.2 mL，1次/天，灌胃；各組小鼠均連續給藥15d。

1.2.3 觀察指標：用藥結束后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，對小鼠進行稱重，完整剝取腫瘤，測量腫瘤體積及重量，并根據抑瘤率=(模型對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/模型對照組平均瘤重×100%，計算抑瘤率。

1.2.4 免疫組織化學法檢測各組Fas、FasL、caspase3及caspase7的表達水平：將部分腫瘤組織(正常對照組取正常組織)常規固定、石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片，室溫下干燥備用。取組織切片脫蠟、水化，采用3%H2O2溶液孵育10 min阻斷內源性過氧化物，將切片置于pH=6.0的枸櫞酸鈉緩沖溶液中加熱進行抗原熱修復，自然冷卻后，分別滴加50 μL Fas、FasL、caspase3及caspase7兔多克隆抗體，置于4 ℃冰箱過夜，37 ℃復溫45 min，PBS沖洗5 min×3次，滴加羊抗兔IgG-HRP標記二抗 50 μL，室溫孵育1 h，PBS沖洗5 min×3次，滴加DAB顯色液進行顯色，10 min后PBS沖洗，滴加蘇木素伊紅染色液進行復染，自來水沖洗10 min，常規脫水、透明、中性樹膠封片。對切片進行鏡檢(×200，×400)，光鏡下細胞胞質呈棕色或黃色顆粒為陽性，隨機選取5個視野，觀察計算陽性細胞表達率。

1.2.5 Western blot法檢測各組Fas、FasL、caspase3及caspase7蛋白的表達水平：取50 mg腫瘤組織(正常對照組取正常組織)，剪碎至勻漿狀，加入1.5 mL胰酶消化細胞，37 ℃恒溫振蕩20 min后，5 000 r/min離心3 min，PBS沖洗2次；加入1 mL裂解液，冷卻30 min，之后1 0000 r/min離心2 min，取上清液；取10 μL上清液，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，之后轉膜，將PVDF膜晾干，置于封閉液中震蕩封閉1 h，沖洗；滴加Fas、FasL、caspase3及caspase7兔多克隆抗體，孵育2 h后PBS沖洗，滴加羊抗兔IgG-HRP標記二抗，孵育60 min，進行顯影定影。采用凝膠圖像處理系統，觀測Fas、FasL、caspase3及caspase7蛋白的光密度值。

2 結果

2.1 各組小鼠腫瘤體積、瘤體重量以及抑瘤率比較 用藥后，與模型對照組比較，白細胞介素組、白花蛇舌草組小鼠腫瘤體積、瘤體重量較低(P<0.05)，與白細胞介素組比較，白花蛇舌草組小鼠腫瘤體積、瘤體重量明顯較低，抑瘤率明顯較高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腫瘤體積、瘤體重量以及抑瘤率比較Tab.1 Comparison of tumor size, weight and tumor inhibition rate

#P<0.05，與模型對照組比較，compared with model control group；△P<0.05，與白細胞介素組比較，compared with interleukin group

2.2 免疫組化法檢測各組小鼠Fas、FasL陽性表達率比較 用藥后，與正常對照組比較，各組小鼠Fas陽性表達率較低，FasL陽性表達率較高(P<0.05)；與模型對照組比較，白細胞介素組、白花蛇舌草組小鼠Fas陽性表達率較高，FasL陽性表達率較低(P<0.05)；與白細胞介素組比較，白花蛇舌草組小鼠Fas陽性表達率較高，FasL陽性表達率較低(P<0.05)。見表2及圖1。

表2 免疫組化法檢測各組小鼠Fas、FasL陽性表達率比較Tab.2 Comparison of positive expressions of Fas and FasL among each group by immunohistochemistry (±s)

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型對照組比較，compared with model control group；△P<0.05，與白細胞介素組比較，compared with interleukin group

圖1 各組Fas及FasL表達情況(×200)A：正常對照組；B：模型對照組；C：白細胞介素組；D：白花蛇舌草組Fig.1 The expressions of Fas and FasL in each group(×200)A：normal control group；B：model control group；C： interleukin group；D：hedyotisdiffusa group

2.3 免疫組化法檢測各組小鼠caspase3、caspase7陽性表達率比較 用藥后，正常對照組比較，各組小鼠caspase3、caspase7陽性表達率較低(P<0.05)；與模型對照組比較，白細胞介素組、白花蛇舌草組小鼠caspase3、caspase7陽性表達率較高(P<0.05)；與白細胞介素組比較，小鼠白花蛇舌草組caspase3、caspase7陽性表達率明顯較高(P<0.05)。見表3及圖2。

表3 免疫組化法檢測各組小鼠caspase3、caspase7陽性表達率比較

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型對照組比較，compared with model control group；△P<0.05，與白細胞介素組比較，compared with interleukin group

圖2 各組caspase3、caspase7表達情況(×400)A：正常對照組；B：模型對照組；C：白細胞介素組；D：白花蛇舌草組Fig.2 Expressions of caspase3 and caspase7 in each group(×400)A：normal control group；B：model control group；C： interleukin group；D：hedyotisdiffusa group

2.4 Western blot法檢測各組小鼠Fas、FasL蛋白表達水平比較 用藥后，與正常對照組比較，各組小鼠Fas蛋白表達水平較低，FasL蛋白表達水平較高(P<0.05)，與模型對照組比較，白細胞介素組、白花蛇舌草組小鼠Fas蛋白表達水平較高， FasL蛋白表達水平較低(P<0.05)；與白細胞介素組比較，白花蛇舌草組小鼠Fas蛋白表達水平較高，FasL蛋白表達水平較低(P<0.05)。見表4、圖3。

表4 Western blot法檢測各組小鼠Fas、FasL蛋白表達水平比較Tab.4 Comparison of expressions of Fas and FasL among each group by Western blot (±s)

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型對照組比較，compared with model control group；△P<0.05，與白細胞介素組比較，compared with interleukin group

圖3 各組Fas、FasL蛋白表達A：模型對照組；B：白細胞介素組；C：白花蛇舌草組；D：正常對照組Fig.3 The expressions of Fas and FasL in each groupA：model control group；B：interleukin group；C：hedyotisdiffusa group；D：normal control group

2.5 Western blot法檢測各組小鼠caspase3、caspase7蛋白表達水平比較 用藥后，與正常對照組比較，各組小鼠caspase3、caspase7蛋白表達水平較低(P<0.05)；與模型對照組比較，白細胞介素組、白花蛇舌草組小鼠caspase3、caspase7蛋白表達水平較高(P<0.05)；與白細胞介素組比較，白花蛇舌草組小鼠caspase3、caspase7蛋白表達水平較高(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 Western blot法檢測各組小鼠caspase3、caspase7蛋白表達水平比較Tab.5 Comparison of expressions of caspase3 and caspase7 among each group by Western blot (±s)

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with normal control group；#P<0.05，與模型對照組比較，compared with model control group；△P<0.05，與白細胞介素組比較，compared with interleukin group

圖4 各組Caspase3、Caspase7蛋白表達A：模型對照組；B：白細胞介素組；C：白花蛇舌草組；D：正常對照組Fig.4 The expressions of caspase 3 and caspase 7 in each groupA：model control group；B：interleukin group；C：hedyotisdiffusa group；D：normal control group

3 討論

中藥白花蛇舌草味苦、淡，性寒，歸心、肝、脾經，具有清熱解毒、消痛散結、利尿除濕的作用，主要用于肺熱喘咳、咽喉腫痛、腸癰、癤腫瘡瘍、癌腫等熱毒疾病的治療，尤善于治療多種癌腫[7]。藥理研究顯示，白花蛇舌草含有萜類、游離二萜醇、香豆素、揮發油類、黃酮類、蒽醌類、多糖類、苯丙素類以及含酸化合物等多種化學成分，具有抗癌、抗氧化、抗炎、免疫調節、保肝、神經保護等作用[8]。趙詩云等[9]采用復方白花蛇舌草治療肺癌荷瘤C57小鼠，發現復方白花蛇舌草能夠抑制荷瘤鼠腫瘤的生長，且聯合環磷酰胺有減毒增效的作用；彭軍等[10]采用白花蛇舌草對結腸癌HT-29細胞進行體外干預，結果發現白花蛇舌草能夠影響HT-29細胞周期相關基因表達，阻滯正常周期進程，從而減少癌細胞增殖。目前關于白花蛇舌草治療腎癌的相關實驗研究較少，故本次研究通過皮下接種Renca細胞建立小鼠腎癌模型，觀察模型小鼠經白花蛇舌草治療后腫瘤生長情況以及腫瘤組織Fas、caspase3及caspase7的表達，探討白花蛇舌草對腎癌的作用。研究結果發現，白花蛇舌草能夠有效抑制腎癌組織的增殖，提高抑瘤率。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序的死亡，而細胞凋亡障礙與惡性腫瘤的發生密切相關[11]。細胞凋亡的過程為接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化(caspase)→進入連續反應→細胞凋亡，Fas、FasL、caspase3及caspase7均為細胞凋亡過程中重要蛋白質。Fas屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，而FasL是Fas的配體，Fas與FasL結合后可以啟動致死性信號轉導，開啟凋亡過程，若Fas/FasL信號轉導系統異常，則會影響細胞正常凋亡。有研究顯示，腎癌組織中Fas表達下調，FasL表達升高，Fas/FasL表達異常是腎癌發生發展的原因之一[12]。本研究免疫組織化學法、Western blot法檢測結果顯示，與模型對照組比較各組小鼠Fas陽性表達率及蛋白表達水平較高(P<0.05)，表明白花蛇舌草對于Fas/FasL信號轉導系統具有調節作用，且作用具有劑量依賴性。

Caspase為半胱氨酸蛋白酶，其被激活亦是細胞凋亡過程中的重要環節[13]，激活的caspase能直接破壞細胞結構，下調與DNA修復相關酶、mRNA剪切蛋白等，抑制細胞增殖并促進凋亡。caspase3和caspase7是caspase家族成員，具有相近的底物和抑制劑特異性，能夠降解聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)，引發級聯反應，直接參與細胞凋亡的執行。有報道稱，caspase3、caspase7的低表達與腎癌的預后不良有關[14]。本研究結果表明白花蛇舌草能夠上調腎癌組織caspase3、caspase7蛋白表達，促進腫瘤細胞凋亡。

本實驗發現白花蛇舌草能夠明顯促進腎癌模型小鼠凋亡相關蛋白Fas、caspase3及caspase7表達，抑制FasL蛋白表達，提高抑瘤率。白花蛇舌草的成分復雜，具體何種成分對腎癌治療有效在本研究中并未明確，需進一步研究證實。

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(編校：王儼儼)

Effect of hedyotisdiffusa on expressions of apoptosis related protein Fas，caspase3 and caspase7 in Renca renal cell carcinoma of model mice

ZHOU JinΔ, ZHAO Peng

(Department of Urological Surgery,Tianjin Nankai Hospital, Tianjin 300100, China)

ObjectiveTo analyse the effect of hedyotisdiffusa on expressions of apoptosis related protein Fas, caspase3 and caspase7 in Renca renal cell carcinoma of model mice.MethodsOne hundred and twenty BALB/C male mice were randomly divided into normal control group, model control group, interleukin group, hedyotisdiffusa group, 30 mice in each group, half male and female.Excepted for normal control group, renal cell carcinoma models were established in the other groups, and were given corresponding drug treatment.The tumor size and weight, and the tumor inhibition rate of all mice were observed, and the expression levels of Fas,FasL,caspase3 and caspase7 were detected.ResultsCompared with model control group, the tumor size and weight were lower, the tumor inhibition rate were higher, the positive expression rates and protein levels of Fas were higher, the positive expression rates and protein levels of FasL were lower, the positive expression rates and expression levels of Caspase3,Caspase7 protein were higher in the mice of interleukin group and hedyotisdiffusa group, all with significant differences (P<0.05).The above indicators in hedyotisdiffusa group were significant improved compared with interleukin group (P<0.05).ConclusionThe hedyotisdiffusa can effectively promote the expressions of apoptosis related protein Fas,caspase3 and caspase7 in renal cell carcinoma of model mice, inhibit the expression of FasL protein, improve the tumor suppression rate.

hedyotisdiffusa; renal cell carcinoma; mice; apoptosis related protein; Fas; caspase

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.009

周進，通信作者，男，碩士，主治醫師，研究方向：泌尿系統，E-mail：zhou6323asd@163.com。

R737.11；R285.5

A