結核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片對活動性與非活動性結核患者療效的評價

宋能，劉焰，段元山，馬杰Δ

(1.湖北省中西醫結合醫院 檢驗科，湖北 武漢 430015；2.武漢大學基礎醫學院 免疫學系，湖北 武漢 430071)

結核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片對活動性與非活動性結核患者療效的評價

宋能1，劉焰2，段元山1，馬杰1Δ

(1.湖北省中西醫結合醫院 檢驗科，湖北 武漢 430015；2.武漢大學基礎醫學院 免疫學系，湖北 武漢 430071)

目的 探討結核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片用于活動性結核患者與非活動性結核患者的診斷價值。方法 采用結核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片分別對湖北省中西醫結合醫院檢驗科178例活動性結核病患者和79例非活動性結核病患者以及92例健康對照血清樣本進行檢測。結果 結核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片對結核病總陽性率為58.4%；3項蛋白的聯合診的輔助診斷價值高于單項蛋白的輔助診斷價值；16kD蛋白對非活動性結核陽性率為16.4%，優于其對活動性結核3.4%的陽性率(P<0.05)。結論 結核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片對活動性結核和非活動性結核均具有一定的輔助診斷價值，在非活動性結核患者中16kD蛋白陽性率略高于38kD蛋白(P<0.05)。

結核分枝桿菌；蛋白芯片；非活動性結核患者；結核診斷

結核病目前仍是發展中國家亟待解決的公共健康問題。據世界衛生組織(WHO)調查報告顯示2012年全球約有130萬人死于結核病[1]。2014年我國結核病發病率的世界排名雖較2013年下降，但仍高居世界第三位，所以早期明確的診斷對結核病的治療及預后有著極其重要的意義[2]。目前臨床上應用的結核病實驗室診斷技術主要有結核菌素(PPD)試驗、痰細菌培養、抗酸染色、PCR、IFN-γ的T-Spot檢測及基因芯片等方法。近年來，國內外相繼報道使用阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)脂多糖、純化蛋白抗原A95，結核菌重組蛋白抗原38kD[3]、16kD[4]和14kD等在結核病抗體檢測中的作用。我國研發出的基因工程表達結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)重組蛋白抗原16kD、38kD、LAM蛋白，利用蛋白芯片技術制成結核分枝桿菌相應抗體檢測試劑盒[5]。本次研究采用國內南京大淵公司的蛋白芯片試劑盒進行臨床檢測試驗，以評價其用于本院活動性結核患者與非活動性結核患者的輔助診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年4月～2016年10月間在湖北省中西醫結合醫院臨床各科室送檢至檢驗科的成年結核病患者257例，其中肺結核129例，淋巴結核64例，骨結核23例，結核性腹膜炎17例，結核性心包炎9例，結核性腦膜炎7例，結核性胸膜炎6例，腎結核2例。其中活動性結核患者178例，其中男性108例，女性70例，年齡范圍19～93歲，平均年齡(42.4±12.5)歲，病程2～36個月，平均病程(6.5±4.9)個月。本文將既往結核患者經聯合用藥后無癥狀復查者，定義為本研究的非活動性結核病患者共79例，其中男性46例，女性33例，年齡范圍為20～82歲，平均年齡(44.56±11.8)歲，病程為5～60個月，平均病程(10±6.2)個月。選取2016年7月～2016年10月間在湖北省中西醫結合醫院體檢中心體檢的健康成年人92例，其中男性56例，女性36例，年齡范圍23～65歲，平均年齡(43.11±8.4)歲，作為本研究的健康對照。本研究經患者知情同意，并得到醫院倫理委員會批準。

結核患者參照Thuaites診斷標準及Thuaites診斷指數[6-7]為依據并將其納入：①肺結核的診斷：a.胸部X線肺葉陰影；b.增強CT掃描結果與X線基本吻合；c.抗酸染色陽性；d.抗結核治療癥狀有顯著改善。②其它部位結核的診斷：a.患病組織病原學檢查陽性；b.血清T-Spot檢測陽性；c.抗結核治療癥狀有顯著改善。各組患者在年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器：結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(南京大淵生物技術工程有限責任公司生產，國食藥監械(準)字2011第3400173號)。大淵PBT-X4型生物芯片識別儀系統Potomac PBT-X4 Bio-chip Scanner System(南京大淵生物技術工程有限責任公司生產)。

1.2.2 樣本的采集：使用黃頭促凝血負壓管抽取患者靜脈血4～5 mL(溶血樣本和高脂血樣本不宜)，取血后顛倒試管2～3次以便促凝劑與血液充分混勻，靜置3～5 min后使用離心機離心，離心條件為：轉數3 500 r/min離心血液6 min。離心后，取上層不少于150 μL血清用于檢測。

1.2.3 檢驗方法：從冰箱中取出芯片與配套試劑，室溫放置10 min平衡至室溫，從鋁箔袋中取出芯片，在芯片上標注待檢者姓名或編號。在平衡至室溫的前提下，在蛋白芯片窗口中用加樣槍加入200 μL試劑A(主要活性成分：2%吐溫、Tris緩沖液)；待窗口中的試劑A浸潤完后，室溫靜置1 min后用加樣槍加入樣本血清100 μL；待樣本血清完全滲入后，及時用加樣槍加入300 μL試劑B(主要活性成分：2%吐溫、Tris緩沖液)；待試劑B完全滲入后，用加樣槍加入500 μL試劑C(主要活性成分：金標抗人IgG)；待試劑C完全滲入后，最后用加樣槍加入300 μL試劑D(主要活性成分：2%吐溫、Tris緩沖液)；4種試劑以及樣本加入完成后，于30 min內將芯片置于大淵PBT-X4型生物芯片識別儀系統相應位置，安生物芯片識別儀檢測操作步驟進行結果分析，系統將自動判讀出檢測結果。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，2組患者的陽性率比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組結核分枝桿菌抗原陽性率的比較 采用χ2檢驗得出，對照組與活動性結核組的陽性率的差異有顯著的統計學意義(P<0.01)。對照組與非活動性結核陽性率也具有顯著的統計學意義(P<0.05)?；顒有越Y核的陽性率為71.3%明顯高于非活動性結核的陽性率29.1%(P<0.05)，結核分枝桿菌IgG抗體蛋白芯片對結核病總陽性率為58.4%。

表1 結核分枝桿菌抗原陽性率的比較Tab.1 Comparison of M. tuberculosis antigen positive rate

2.2 兩類結核病與3種抗原蛋白檢測陽性率的比較 結果如表2中所示：LAM蛋白在活動性結核(陽性率67.4%)與非活動性結核(陽性率24%)檢測結果中其陽性率均為最高，差異具有統計學意義(P<0.05)，活動性結核患者16kD蛋白16.4%的陽性率明顯高于非活動性結核患者16 kD蛋白3.4%的陽性率，差異有顯著的統計學意義(P<0.05)。

表2 不同結核抗體蛋白檢測陽性率的比較[n(%)]Tab.2 Comparison positive rate of different M.tuberculosis antibody proteins[n(%)]

3 討論

結核病是由M.tuberculosis引起的一種慢性傳染病，該病嚴重威脅人類健康。早期結核患者往往僅有低熱、乏力、消瘦等一般性癥狀，特別是目前發病率越來越高的肺外結核，如癥狀并不明顯的肝結核、胰結核、腎結核、腹膜結核、骨結核等，使傳統的結核病診斷手段例如X-線檢查[8]、積液痰液微生物學檢查[9]等陽性率并不盡如人意。雖然近年來有很多新技術例如ddPCR對結核病的診斷靈敏度有很大的提升[10]，但是迫于成本壓力使得其普及仍有待時日。單項輔助診斷的各種缺點，使大量結核病患者未能被及時診斷而延誤了治療時機，導致體內大量結核結節形成，這些結核結節的存在一直被懷疑是導致非活動性結核患者后期結核復發的根源[11]。

LAM是M.tuberculosis細胞壁脂多糖的主要成分，分子量為17.5kDa[12]。它的結構復雜，包含三個不同的結構域。在人體內慢性生長的結核分枝桿菌菌體表面的糖脂結構中，部分LAM鏈的非還原性末端有相應的帽結構存在，這種結構能改變人體免疫系統對M.tuberculosis的免疫調節方式。國內有實驗證明，M.tuberculosis菌體表面的LAM結構能幫助它抑制巨噬細胞對其的殺傷，導致巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌之后，使其在巨噬細胞內潛伏并生存[13]。作為檢測M.tuberculosis的特異分子，由于LAM在其它類型的分枝桿菌表面含量很低，無法像M.tuberculosis一樣刺激人體免疫系統產生大量的特異性抗體，故其特異度要明顯優于其它抗原分子。38 kD蛋白是M.tuberculosis蛋白抗原之一，以一種類脂蛋白，它對M.tuberculosis的生長具有重要的生化和調節作用[14]。Haslov等比較了包括38 kD蛋白在內(不包括LAM)的五種結核分枝桿菌抗原，他發現38 kD蛋白所產生的免疫效應最強，而且缺乏38 kD蛋白抗體的血清很難與結核分枝桿菌的其他抗原產生反應[15-16]。關于16 kD蛋白的報道，并不如以上兩種蛋白多，對于該蛋白多見于休眠期結核分枝桿菌中，而在其它非結核分枝桿菌中不存在該蛋白的表達，故其它分枝桿菌對機體的感染并不能誘導產生抗16 kD蛋白抗體[5]。

結核蛋白芯片技術是以微孔濾膜為載體, 同時將結核菌的細胞壁脂多糖LAM抗原和結核菌16 kD和38 kD抗原固定在微孔濾膜上, 利用微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝集作用，借助抗原抗體反應與患者血清中的特異性抗體結合，再與人源性抗體混合，利用膠體金法，在微孔濾膜上形成紫紅色斑點。反應完成后30 min內，使用廠家提供的芯片識別儀掃描并使用芯片識別系統進行結果分析，同時檢測出患者血清中所含的細胞壁脂多糖LAM的抗體、38 kD抗體和16 kD抗體。這3種抗體的同步檢測，對結核分枝菌感染具有輔助診斷價值[17]。除了對肺結核的診斷，國內一些學者通過分析病例也證明了結核蛋白芯片對肺外結核患者診斷的優越性[5]。

本研究結果顯示結核蛋白芯片檢測總的陽性率為45.0%。在患病部位的結核病人中陽性率差別較大,但無論是在活動性還是非活動性結核患者中LAM蛋白都比16 kD蛋白和38 kD蛋白的陽性率要高(P<0.05)。LAM作為M.tuberculosis細胞壁的表面抗原，其特異性強，有較強的免疫源性，在感染的宿主內，常會引起強烈的抗體反應，能有效刺激機體產生IgG型的抗LAM抗體。故無論是活動性還是非活動性結核患者，其陽性率都為最高(P<0.05)?；顒有越Y核患者的檢測結果顯示，3種抗體以LAM蛋白最為靈敏,38 kD蛋白次之,16 kD蛋白最差；對非活動性結核患者的檢測顯示，3種抗體仍以LAM蛋白最為靈敏，但是16 kD蛋白次之，38 kD蛋白最差。16 kD蛋白對非活動性結核患者的陽性率明顯高于結核患者(P<0.05)，其原因有待進一步探索。

M.tuberculosisIgG抗體蛋白芯片檢測速度快，采取血液樣本離心之后，只需要10 min左右就能判定出相應抗體的陰陽性，方便單人操作，提高了工作效率與檢驗效率，公司提供配套的芯片灰度掃描儀，基本消除了肉眼判讀的誤差，質控數據量化，相比其他的結核檢測具有一定的優勢，其特異性也基本令人滿意。并且該芯片采用了3種抗體聯合檢測，相比單抗體檢測提高了檢測的陽性率，而且該技術不受外國專利壟斷，價格親民，是一種值得推廣的結核檢測技術。

[1] Glaziou P,Floyd K,Raviglione M.Global burden and epidemiology of tuberculosis[J].Clin Chest Med.2009,30(4):621-636.

[2] Glaziou P,Sismanidis C,Floyd K,et al.Global epidemiology of tuberculosis[J].Cold Spring Harb Perspect Med.2015,5(2):a17798.

[3] Bothamley G H.Serological diagnosis of tuberculosis[J].Eur Respir J Suppl.1995,20:676-688.

[4] Hu Y M,Butcher P D,Sole K,et al.Protein synthesis is shutdown in dormant Mycobacterium tuberculosis and is reversed by oxygen or heat shock[J].FEMS Microbiol Lett.1998,158(1):139-145.

[5] 楊群，江曉靜.結核蛋白芯片對肺結核及肺外結核的診斷價值[J].西安交通大學學報(醫學版).2012(1)：129-131.

[6] Thwaites G E,Chau T T,Stepniewska K,et al.Diagnosis of adult tuberculous meningitis by use of clinical and laboratory features[J].Lancet.2002,360(9342):1287-1292.

[7] Thwaites G E,Nguyen D B,Nguyen H D,et al.Dexamethasone for the treatment of tuberculous meningitis in adolescents and adults[J].N Engl J Med.2004,351(17):1741-1751.

[8] 董莘，秦崇，敖國昆.活動性和非活動性結核的薄層CT特征[J].中華臨床醫師雜志(電子版).2011(20)：5919-5924.

[9] 全國結核病流行病學抽樣調查技術指導組.2000年全國結核病流行病學抽樣調查報告[J].中國防癆雜志.2002(2)：3-46.

[10] 宋能，譚楊，羅鳳玲，等.微滴數字PCR定量檢測全血樣品中結核分枝桿菌特異CFP10基因[J].中國生化藥物雜志.2016(2)：10-15.

[11] 桂錢歡，李波，余雨，等.胸腰椎結核前路術后復發的原因及再手術治療[J].臨床骨科雜志.2016(2)：133-136.

[12] Pienaar M,Andronikou S,van Toorn R.MRI to demonstrate diagnostic features and complications of TBM not seen with CT[J].Childs Nerv Syst.2009,25(8):941-947.

[13] 王一鳴，陶晶，郭曉奎，等.蛋白質組學在結核分枝桿菌研究中的應用[J].微生物學通報.2009(2)：245-249.

[14] Young DB,Garbe TR.Lipoprotein antigens of Mycobacterium tuberculosis[J].Res Microbiol.1991,142(1):55-65.

[15] Wilkins EG,Ivanyi J.Potential value of serology for diagnosis of extrapulmonary tuberculosis[J].Lancet.1990,336(8716):641-644.

[16] Haslov K,Andersen A B,Ljungqvist L,et al.Comparison of the immunological activity of five defined antigens from Mycobacterium tuberculosis in seven inbred guinea pig strains.The 38-kDa antigen is immunodominant[J].Scand J Immunol.1990,31(4):503-514.

[17] 段慧萍，郭東菊.結核蛋白芯片檢測對結核病診斷的價值[J].山西醫科大學學報.2010(8):716-718.

(編校：師維康)

Evaluation ofmycobacteriumtuberculosisIgG antibody protein chip in patients with active and inactive tuberculosis

SONG Neng1, LIU Yan2, DUAN Yuan-shan, MA Jie1Δ

(1. Clinical Laboratory, Hubei Provincial Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine, Wuhan 430015, China; 2. Department of Immunology, Wuhan University School of Basic Medical Sciences, Wuhan 430015, China)

ObjectiveTo explore protein microarray chip diagnostic value for patients with active and inactivetuberculosis.Methods178 cases of active patients tuberculosis and 79 cases of inactive tuberculosis patients and 92 cases of healthy control using protein microarray chip detection.ResultsTuberculosisprotein chip had a diagnostic value fortuberculosisand the positive rate is 58.4%; combined the diagnostic value of three kinds of proteins is higher than the diagnostic value of a single protein；16 kD protein of inactivetuberculosispositive rate was 16.4%, better than the positive rate of 3.4% for active tuberculosis (P<0.05).ConclusionTuberculosis protein chip has a diagnostic value for activetuberculosisand inactive tuberculosis. 16 kD protein positive rate more than 38 kD protein in patients with inactivetuberculosis(P<0.05).

M.tuberculosis; protein microarray chip; inactivetuberculosis; diagnosis oftuberculosis

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.050

宋能，男，碩士，檢驗科醫師，研究方向：臨床免疫學與分子生物學診斷，E-mail：Soner2008@qq.com；馬杰，通信作者，女，碩士生導師，檢驗科主任，研究方向：臨床免疫學與分子生物學檢驗，E-mail：majie588@126.com。

R378.91+1；R825.2

A