新生大鼠缺氧缺血性腦損傷TLR4表達及與細胞凋亡的關系

梁桂娟，王迎濤，劉艷紅，唐成和，關海山鄭州人民醫院新生兒科，河南鄭州45005；中國人民解放軍5醫院檢驗中心，河南鄭州45004；新鄉醫學院第一附屬醫院新生兒科，河南新鄉4500

新生大鼠缺氧缺血性腦損傷TLR4表達及與細胞凋亡的關系

梁桂娟1，王迎濤2，劉艷紅1，唐成和3，關海山11鄭州人民醫院新生兒科，河南鄭州450053；2中國人民解放軍153醫院檢驗中心，河南鄭州450042；3新鄉醫學院第一附屬醫院新生兒科，河南新鄉453003

目的通過檢測TLR4在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）中表達變化，并與凋亡情況對比，研究TLR4在新生兒缺氧缺血性腦損傷發病機制中的作用，為臨床的進一步研究提供客觀的實驗依據。方法選取80只7 d齡新生健康大鼠，隨機分為實驗組和對照組各40只。TUNEL法檢測腦組織細胞凋亡狀況，免疫組化SP法檢測TLR4表達變化。結果細胞凋亡缺氧缺血術后6 h陽性率上升，至24 h達到高峰，72 h和7 d表達下降。TlR4實驗組于缺氧缺血6 h即出現陽性表達，12 h表達到峰值，24 h無明顯變化，72 h和7 d表達下降。實驗組與對照組在各時間點比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。TLR4與細胞凋亡呈正相關（r=0.452）。結論新生大鼠缺氧缺血性腦損傷組織中TLR4高表達，可能促進細胞凋亡發生，在腦損害的形成過程中起到了重要的作用。

新生大鼠；缺氧缺血；腦損傷；TLR4；凋亡

新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）是由圍生期各種因素引起的部分或完全性缺氧，腦血流量減少或暫停而導致的胎兒和新生兒的腦損傷，多見于足月兒，導致不可逆的腦損傷，是新生兒死亡和繼發智力障礙、腦癱等傷殘的主要原因之一，新生兒HIE發病率為（1～80）/1000，在這其中10%～20%在新生兒期死亡，存活的25%～30%可能會留有遠期神經發育后遺癥，以致嚴重威脅新生兒的生命健康，給家庭和社會造成了沉重的負擔，也使產科和兒科醫師面臨著極大的壓力［1］。缺氧是發病的核心，其中圍生期窒息是最主要病因已被廣泛接受［2-5］，它的發病機制、干預策略和影響遠期預后的研究，一直是普遍關注的熱點問題。近年來國內外對新生兒缺氧缺血性腦病的基礎和臨床進行了大量的研究，但目前仍未取得突破性進展，臨床上也無特異的治療方法［6］。因此，致力于新生兒缺氧缺血性腦病的發病機制研究，有著非常重要的臨床意義。這次研究通過觀察TLR4在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷（HIBD）模型中表達變化，并與凋亡情況對比，探討其在新生兒缺氧缺血性腦損傷發病機制中的作用，為新生兒缺氧缺血性腦病防治提供理論依據。

1　資料與方法

1.1實驗對象

研究對象選取80只健康新生7 d齡SD大鼠，無性別選擇，體質量12～15 g，完全隨機方法分為實驗組、對照組各40只；再將2組大鼠隨機分為6、12、24、72 h、7 d組，每組8只，分別于大鼠足部貼上標簽。

1.2方法與觀察指標

參照Rice法［7］7日齡大鼠建立缺氧缺血性腦損傷模型，將實驗組大鼠的左側頸總動脈結扎，并置于8%O2+ 92%N2的氮氧混合器環境2 h，建立實驗動物模型。對照組僅分離左側頸總動脈，不予結扎和缺氧處理。分別于術后6、12、24、72 h和7 d對2組大鼠行心臟灌注，斷頭取腦制作成石蠟標本，顯微鏡下觀察標本變化情況，TUNEL法檢測腦組織細胞凋亡狀況，免疫組化SP法檢測TLR4表達變化；記錄2組大鼠的一般情況、體質量、行為學變化等。

1.3統計學分析

采用SPSS17.0進行統計學處理，全部結果用均數±標準差表示。實驗組和對照組差異有無統計學意義采用兩獨立樣本t檢驗。

2　結果

2.1實驗組動物體質量、行為學改變及病理變化

實驗組體質量增長明顯慢于對照組，有顯著差異。缺氧缺血后新生大鼠出現程度不等的行為變化，如躁動不安、全身發紺、四肢強直抽動。HE染色：缺氧缺血后6 h左側腦神經細胞水腫和少量局灶性壞死；缺血缺氧后18～24 h，左側皮質腦組織壞死面積逐漸增大，24～48 h可見大面積壞死。72 h可見界限清楚的壞死灶。

2.2細胞凋亡陽性率在腦損傷過程中的表達變化

實驗組細胞凋亡陽性表達率隨時間變化動態變化，6 h開始表達，此后逐步上升，24 h達到峰值，3 d細胞凋亡陽性率下降。對照組細胞凋亡陽性率各時間點無明顯變化。實驗組與對照組在6、12、24、72 h、7 d 5個觀察時間點比較均有統計學意義（P＜0.05，表1）。實驗組12 h和24 h相比P＞0.05，其余實驗組各時間點間兩兩比較P＜0.05。在陰性對照圖片中，未見陽性細胞。

表1　實驗組與對照組大腦皮質區凋亡細胞陽性率比較（n=40，x±s）

2.3TLR4的表達變化

實驗組和對照組新生大鼠腦組織均可見TLR4的表達，對照組表達量少，且無明顯變化。實驗組于缺氧缺血后6 h表達開始增加，12 h表達達到高峰，24 h無明顯變化，72 h和7 d表達下降，12 h和24 h組間比較無統計學意義（P＞0.05），其余組間各時間點比較均有統計學意（P＜0.05，表2）。實驗組同對照組各個時間點的結果存在顯著差異，實驗組12 h和24 h相比P＞0.05，其余實驗組各時間點間兩兩比較P均＜0.05。

2.4TLR4表達水平與其細胞凋亡相關性分析

表2　實驗組與對照組大腦皮質TLR4平均光密度（n=40±s）

表2　實驗組與對照組大腦皮質TLR4平均光密度（n=40±s）

*P＞0.05（實驗組12 h vs實驗組24 h）.

分組對照組實驗組t P 6 h 0.0111±0.0008 0.3271±0.0333* 26.86 ＜0.05 12 h 0.0105±0.0014 0.4359±0.0428* 28.127 ＜0.05 24 h 0.0114±0.0007 0.4342±0.0428* 27.945 ＜0.05 72 h 0.0105±0.0013 0.3005±0.0209* 38.974 ＜0.05 7 d 0.0112±0.0023 0.2744±0.0288* 25.73 ＜0.05

新生大鼠缺氧缺血后大腦皮質內TLR4與凋亡細胞的表達水平呈正相關關系（r=0.452，P＜0.01），即在一定時間內（HIBD 24 h內）隨TLR4表達的逐漸增多，凋亡細胞的表達也呈現上升趨勢；在一定時間內（HIBD 72 h后）隨TLR4表達的逐漸減少，凋亡細胞的表達也呈現下降趨勢。

3　討論

新生兒缺氧缺血性腦病發病率為0.2%～0.4%，是新生兒期最常見的腦損傷。重者致患兒死亡，部分可遺留智力低下、腦癱及癲癇等嚴重的神經系統損害［8］。1995年首次應用HE染色和DNA電泳方法，在實驗性HIBD模型鼠腦皮質、海馬、丘腦證明新生大鼠單側腦缺血缺氧后，在腦組織細胞中發現有凋亡特異性的斷裂DNA出現［9］。此實驗顯示缺氧缺血后6 h可見凋亡細胞，12 h明顯增多，24 h達到高峰，72 h凋亡指數下降，與對照組比較各個時間點均有顯著差異，與此次實驗蘇木精-伊紅染色所示病理改變的嚴重程度相對應，這就提示細胞凋亡可能是新生大鼠腦損傷的重要機制之一。

有研究表明促炎癥介質的產生和釋放是介導細胞凋亡的主要因素之一，可加重缺氧缺血性腦細胞的損傷［10-11］，TLRs作為固有免疫反應關鍵的模式識別受體之一，在誘導炎癥反應和炎癥介質產生中有著重要作用［12］。其中，TLR4主要表達在小膠質細胞，在神經元及星形膠質細胞中也有表達［13］。當缺氧缺血腦損傷釋放大量內源性激活物，TLR4能誘導MyD88依賴和TRIF依賴的兩個信號通路，從而觸發一系列級聯免疫炎癥反應，導致炎癥反應失控［14］。實驗研究發現：TLR4實驗組在缺血6 h表達逐漸增強，24 h達到峰值后下降，3～7 d較假手術組仍高表達，其表達規律與國內外研究結果相符［15］，提示TLR4作為炎性損傷因子，可能參與了缺氧缺血后腦損傷。且TLR4表達與細胞凋亡達到高峰的時間一致，說明在新生兒缺血缺氧性腦病中由TLR4介導的炎癥信號通路的過度激活，可能引起大量與腦損傷密切相關的炎性介質的釋放，通過誘導細胞凋亡加重腦組織損傷，這與Jung等［16］用革蘭陰性菌的脂多糖激活TLR4信號通路刺激試管內培養的鼠的小膠質細胞，導致細胞凋亡的結果相符，提示TLR4與細胞凋亡之間可能存在關聯。因此HIBD后通過阻斷TLR4，可能早期阻斷凋亡的發生，從而預防HIBD的發生。

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The correlation between TLR4 expression and apoptosis of hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats

LIANG Guijuan1，WANG Yingtao2，LIU Yanhong1，TANG Chenghe3，GUAN Haishan11Department of Neonatology，The People's Hospital of Zhengzhou，Zhengzhou 450053，China；2Laboratory Center of the PLA No.153 Hospital，Zhengzhou 450042，China；3Department of Neonatology，The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China

Objective To investigate the role of TLR4 in HIBD by observing the change of TLR4 expression and cell apoptosis after hypoxic-ischemic brain damage（HIBD）in a neonatal rat model，and provide an experimental foundation for the futher clinical research.Methods A total of 80 7day postnatal Sprague-Dawley rats were randomly divided into experimental group （n=40）and control group（n=40）.The expression of TLR4 was tested by immunohistochemistry，the apoptotic hippocampus cells were tested by TUNEL.Results The cell apoptosis and the expression of TLR4 increased at HI 6 h，and achieved the hightest increases at HI 12 h，and it continued to maintain the high level in HI 24 h，then decreased at HI 72 h、HI7 d group.There were significant differences of positive rate at different times compared with control group（P＜0.05）.There was a positive correlation between apoptosis and TLR4（r=0.452）in rats with hypoxic-ischemic brain damage.Conclusion TLR4 over expressed in HIBD can promote cell apoptosis，and play an important role in the pathogenesis of HIBD.

neonatal rats；hypoxia-ischemia；brain damage；TLR4；apoptosis

2016-02-01

梁桂娟，E-mail:liangguijuan2008@163.com

唐成和，E-mail:tchexer@126.com