子囊菌門無性產孢brlA基因家族的系統發育分析

胡珍珠　楊志輝　刁琢

摘要：無性產孢基因brlA在子囊菌產孢的中心調控通路中控制分生孢子梗的形成，brlA基因的激活是曲霉屬真菌產孢的一個關鍵步驟。以子囊菌門已測序的無性產孢brlA基因家族的60條核苷酸序列為材料，用鄰接法、最小進化法構建系統發育樹，分析該基因家族在子囊菌中的演化關系。結果表明：以brlA基因家族序列所構建的系統發育樹共形成了穩定的、高支持率的Ⅰ～Ⅳ共4個大分支；該系統發育樹又可細分為以子囊菌8個目為代表的8個小分支，即爪甲團囊菌目（Onygenales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、格孢腔菌目（Pleosporales）、肉座菌目（Hypocreales）、小叢殼目（Glomerellales）、糞殼菌目（Sordariales）、柔膜菌目（Helotiales）、散囊菌目（Eurotiales）。由結果可知，子囊菌門無性產孢brlA基因家族的演化與子囊菌高級分類階元目的演化相對應，為子囊菌門不同類群間分生孢子梗演化學方面的研究提供可靠的分子證據。

關鍵詞：子囊菌門；無性產孢；brlA；基因家族；系統發育樹

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0048-04

無性孢子的形成是大多數子囊菌最常見的繁殖方式，包括特定的細胞分化、基因表達的時空調控和細胞信號轉導[1]。分生孢子是高等真菌的無性孢子，對保持長期生存發育有重要作用[2]。

子囊菌門曲霉屬的分生孢子在分生孢子梗上形成[3]，分生孢子梗的形態是曲霉屬一個重要的分類學依據。構巢曲霉分生孢子的形成在形態學上被分為幾個不同的階段[4]：首先是基細胞分支出氣生梗，然后梗的尖端開始腫脹形成多核囊泡；在囊泡表面形成2層小梗，分別是?；?、瓶梗；最后，瓶梗經歷了重復的不對稱的有絲分裂，產生了分生孢子鏈。產孢的整個過程都是特定的，并且不同的基因組合在每個階段行使的功能不同[5]。

brlA、abaA、wetA這3個基因組成調控分生孢子特定基因表達的中心調控通路，并決定分生孢子梗形成、孢子成熟過程中基因激活的順序[6]。brlA基因的激活是曲霉屬產孢的一個關鍵步驟，brlA在從分生孢子梗極化的頂端生長到囊泡腫脹的轉型期是必需的[7]。敲除brlA的突變體形成剛毛狀的結構，產生1個細長的梗，從而不能產生囊泡或者其他后續的產孢結構[8]；相反，brlA在生長的細胞中超表達會導致生長中斷，并且從菌絲尖端直接形成可育的分生孢子[9]。brlA有1個復合結構，包含2個重疊的轉錄本brlAα、brlAβ，在分生孢子發育過程中起著不同的作用[10]。BrlA蛋白主要定位于囊泡或小梗上。AbaA是瓶梗分化的主要成分，在分生孢子發育中期階段被BrlA激活[11]。wetA基因在分生孢子形成的晚期被AbaA誘導，并且在使分生孢子成熟的過程中起重要作用[12]。

子囊菌門絕大多數都可產生無性的分生孢子，但是分生孢子的產生方式、形態有很大差別，而控制其產生的關鍵基因brlA基因家族在不同類群中的系統發育關系對揭示其孢子產生方式和形態的不同有重要價值，也為該基因家族基因的分子演化提供數據支撐。因此，本研究從GenBank中下載子囊菌門8個目的brlA基因家族的60條核苷酸序列，用鄰接法、最小進化法構建子囊菌門brlA基因家族高級分類階元的系統發育樹，并對其系統發育關系進行分析。

1 材料與方法

1.1 brlA基因的核苷酸序列

brlA基因的核苷酸序列來自GenBank數據庫，通過該數據庫下載子囊菌8個目中60條含有brlA基因的核苷酸序列，其中散囊菌目（Eurotiales）15條，爪甲團囊菌目（Onygenales）9條，肉座菌目（Hypocreales）7條，格孢腔菌目（Pleosporales）8條，刺盾炱目（Chaetothyriales）、糞殼菌目（Sordariales）各6條，小叢殼目（Glomerellales）5條，柔膜菌目（Helotiales）4條（表1）。

1.2 序列分析

對所下載序列按照GenBank登錄號進行重命名后，用MEGA 6軟件[13]中的ClustalW進行比對后剪切。

1.3 系統發育樹的構建

用MEGA 6軟件[13]，采用鄰接法、最小進化法對已剪切的序列進行系統發育樹的構建，bootstrap值重復1 000次，隱藏50%以下的支持率。

2 結果與分析

2.1 brlA基因的系統發育分類

利用鄰接法、最小進化法對brlA基因的核苷酸序列所構建的2個系統發育樹的拓撲結構基本一致。由鄰接法對核苷酸序列所構建的系統發育樹（圖1）可以看出，所構建的子囊菌門無性產孢brlA基因家族的系統發育樹形成了4個高bootstrap值所支持的即Ⅰ～Ⅳ等大分支。其中，分支Ⅰ包括爪甲團囊菌目（Onygenales）、刺盾炱目（Chaetothyriales），這2個目聚到一起的支持率為84%，都屬于散囊菌綱（Eurotiomycetes）；分支Ⅱ為支持率為99%的格孢腔菌目（Pleosporales）；分支Ⅲ包括肉座菌目（Hypocreales）、小叢殼目（Glomerellales）、糞殼菌目（Sordariales）、柔膜菌目（Helotiales）等4個目，除柔膜菌目屬于錘舌菌綱外，其余3個目均為糞殼菌綱；分支Ⅳ為散囊菌目（Eurotiales），單獨聚為1個支，屬散囊菌綱（Eurotiomycetes）。

而上述4個大分支又可劃分為以子囊菌門下所屬目為代表的8個末端小分支，即爪甲團囊菌目（Onygenales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、格孢腔菌目（Pleosporales）、肉座菌目（Hypocreales）、小叢殼目（Glomerellales）、糞殼菌目（Sordariales）、柔膜菌目（Helotiales）和散囊菌目（Eurotiales）（圖1）。

2.2 brlA基因家族演化與子囊菌演化間關系的分析

由文獻[14]可知，散囊菌目（Eurotiales）、爪甲團囊菌目（Onygenales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）歸為散囊菌綱（Eurotiomycetes），肉座菌目（Hypocreales）、糞殼菌目（Sordariales）、小叢殼目（Glomerellales）歸為糞殼菌綱（Sordariomycetes），格孢腔菌目（Pleosporales）歸為座囊菌綱（Dothideomycetes），柔膜菌目（Helotiales）歸為錘舌菌綱（Leotiomycetes）。將子囊菌產孢相關基因brlA的核苷酸序列進行系統發育樹分析可知，該樹劃分為Ⅰ～Ⅳ4個大分支，而形成的8個小分支按子囊菌的8個目分類。分支Ⅰ包含的爪甲團囊菌目（Onygenales）、刺盾炱目（Chaetothyriales）均屬于散囊菌綱，且2個目聚到一起的支持率較高；爪甲團囊菌目（Onygenales）中，還有1株散囊菌目的青霉菌XM_002560241也與之聚到了一起；分支Ⅱ以座囊菌綱中的格孢腔菌目為代表；分支Ⅲ包括的4個目中，除柔膜菌目屬于錘舌菌綱外，其余3個目均為糞殼菌綱；分支Ⅳ以散囊菌目為代表，聚成1個大分支。

由圖1可知，無性產孢brlA基因家族的演化關系與子囊菌高級分類階元的演化關系基本一致。形成的8個小分支中的每個分支分別以子囊菌的1個目為代表，且親緣關系較近的目聚到一起的支持率也較大。

3 結論與討論

在真菌中，子囊菌門是最大的1個門，呈現最廣泛、最復雜的分化現象。其中，無性產孢是一種主要的繁殖方式，對其產孢機制及相關基因的研究情況已有大量報道[15]。子囊菌門不同類群間所共有的brlA基因是其無性產孢過程中分生孢子梗形成階段所必需的基因，是保證子囊菌無性產孢順利進行的內在因素。

子囊菌門無性產孢brlA基因家族以目為代表的高級分類階元的brlA基因間存在巨大差異，而同一目不同種屬間的差異相對較小，這表明該基因在進化過程中受到了與子囊菌門高級分類單元間類群分化的嚴重正選擇作用。但是也有例外，如本屬于散囊菌目的XM_002560241這株青霉菌與爪甲團囊菌目聚到了 一起，且支持率高達82%，可能是由于散囊菌目、爪甲團囊菌目同屬于散囊菌綱[14]。在子囊菌門更高分類階元綱的水平上，brlA基因家族的演化與其綱的目前分類系統沒有很明確的對應關系，如散囊菌目與同屬于散囊菌綱的爪甲團囊菌目、刺盾炱目未聚到一起，這值得進一步論證，而爪甲團囊菌目、刺盾炱目聚到一起的支持率高達84%。此系統發育樹中，柔膜菌目與糞殼菌綱的3個目聚到了一起，推測是由于柔膜菌目所屬的錘舌菌綱與糞殼菌綱關系較近，均屬于盤菌亞門[16-17]。這也從另外一個側面表明，囊菌門綱的劃分及之間的系統發育關系仍須進一步研究。

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