蓬蘽懸鉤子組織培養繁殖技術

陳曉丹　李愛民　張正海

摘要：以蓬蘽懸鉤子的帶腋芽嫩莖段為外植體，建立組織培養再生體系。結果表明：適宜腋芽誘導培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，誘導率可達86.7%；適宜增殖培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；適宜生根培養基為改良的1/2MS+0.1 mg/L NAA；適宜煉苗時間為7 d，移栽成活率可達98%；以6月中旬移栽到大田的當年苗木生長發育狀態最佳。

關鍵詞：蓬蘽懸鉤子；初代培養；繼代培養；根誘導；移栽

中圖分類號： S663.204+.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0074-02

蓬蘽懸鉤子（Rubus crataegifolius Bunge）為薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）植物，別稱托盤兒、覆盆子等，是我國長白山區分布量較大的野生樹莓種質資源。蓬蘽懸鉤子抗寒性強，果實品質好、營養豐富[1]，且根、莖、葉、果均可入藥[2-3]，開發利用前景廣闊。2013年以來，筆者在系統開展蓬蘽懸鉤子野生馴化研究的同時，進行組織培養快繁技術研究，以期為優良種質資源快速高效利用、建立我國寒地特色樹莓產區、實現栽培良種化和生產規范化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料（嫩莖）取自中國農業科學院特產研究所實驗基地（吉林市昌邑區左家鎮）蓬蘽懸鉤子栽培試驗園。

1.2 試驗方法

1.2.1 啟動培養 在5月中下旬，選擇生長健壯且無病蟲害的蓬蘽懸鉤子單株，剪取嫩梢。在室內剪去嫩梢葉片，剪成 2 cm 左右的帶芽莖段。莖段用適當濃度洗衣粉液浸泡 20 min，自來水沖洗12 h后接種。接種前先用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3次，再以0.1% HgCl2溶液處理10 min，用無菌水沖洗4～5次。將消毒莖段上下部切去少許，分別接種于B5、MS、改良的1/2MS（大量元素、微量元素、鐵鹽和肌醇均減半）和改良的1/4MS（大量元素、微量元素、鐵鹽和肌醇均減為正常量的1/4）的誘導培養基上（以上培養基均附加0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA），每個處理接種20瓶，每瓶3個莖段。接種后，每周觀察外植體生長狀況，2周后統計側芽萌動情況，計算萌發率。

萌芽率=萌芽數/接種數×100%

；

平均萌芽數=萌芽總數/接種數

。

1.2.2 繼代培養 將啟動培養中獲得的無菌芽苗進行增殖培養。以MS為基本培養基，附加不同濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.3 mg/L），每個處理3次重復，每個處理接種10瓶（每瓶4個外植體），50 d后觀察芽的分化和生長狀況，并統計分析各處理芽的增殖倍數。

1.2.3 生根培養 將繼代培養得到的大量增殖苗分離后轉入生根培養基中。生根培養以改良的1/2MS為基本培養基，附加不同濃度的NAA（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 mg/L），每種培養基接種15瓶（每瓶3株無根苗），接種30 d后，觀察試管苗生根和苗木生長情況并統計生根率、平均生根數和平均根長。 相關公式為：生根率=生根苗數/接種數×100%；平均生根數=總根數/生根苗數；平均根長=根的總長度/總生根數。

1.2.4 煉苗移栽 當根長至2～3 cm時，將通過生根培養得到的生根苗分別進行3、7、10 d煉苗，然后以細河沙與腐殖土按1 ∶ 3的比例混合作為移栽基質，在移栽前1 d用0.2%高錳酸鉀溶液消毒基質并覆膜24 h，并加強移栽后的環境調控，以期獲得較高的移栽成活率。

1.2.5 當年苗木生長發育狀況調查 分別于5月中旬、6月中旬和7月中旬將移栽到營養缽中的小苗進行圃地栽培，并于5個月后，即生長期結束后，對其生長發育情況進行調查分析。相關公式為：平均分蘗數=總分蘗數/總苗數；平均莖粗=總莖粗/總苗數；平均生長高度=生長高度總和/總苗數；平均成熟高度=主干的平均生長高度-主干梢部枯死的平均長度。

1.3 培養條件

在以上培養基中加3%蔗糖、0.5%瓊脂，調節pH值為58～6.0。培養條件：溫度為（25±3）℃，光照度為1 000～2 000 lx，光—暗周期為14 h—10 h。

2 結果與分析

2.1 初代培養

表1試驗結果表明，不同的基本培養基中外植體的萌芽率差異顯著，其中基本培養基以MS對蓬蘽懸鉤子嫩莖的誘導效果最好，接種3 d后就開始啟動萌發，培養 20 d 時萌芽率達到86.7%，外植體在培養基上生長良好，葉大嫩綠，芽體較高；其次是改良的1/2MS、1/4MS，培養20 d時萌芽率分別達到66.7%、60.0%，外植體生長一般，葉梢小且偏黃綠色，芽體略矮小。而在B5培養基上，一方面外植體發生的褐化現象嚴重，另一方面接種5 d后才開始緩慢萌發且萌芽率很低，只有28.5%，此外芽體很小，呈黃綠色。綜合以上分析可知，蓬蘽懸鉤子初代培養以MS作為基本培養基為宜。

2.2 增殖培養

將誘導得到的萌發芽體接種到增殖培養基中后，圍繞芽體這一中心，都能分化出一定數量的不定芽。6-BA、NAA不同濃度組合的增殖倍數之間存在顯著性差異，因為6-BA、NAA 2種激素與芽體增殖密切相關，激素的絕對濃度和搭配比例對組培苗的增殖有很大的影響。當6-BA濃度為 1.0 mg/L、NAA濃度為0.2 mg/L時，增殖倍數最高，可達 33.14；當6-BA濃度為1.5 mg/L、NAA濃度為0.1 mg/L時，增殖倍數次之，為32.85。這2個處理（即處理5、處理7）的增殖倍數沒有顯著差異（表2）。因此，適宜蓬蘽懸鉤子的增殖培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

2.3 根的誘導

不同濃度的NAA與蓬蘽懸鉤子無根苗生根率均有密切關系，在9種培養基中都能誘導生根，即在生根培養基中不添加生長素也可生根。當NAA濃度為0.05、0.10 mg/L時，平均生根數之間差異不顯著，但平均根長差異顯著。當NAA濃度大于0.15 mg/L時，組培苗基部膨大產生愈傷組織塊，植株矮小，葉片黃化，不適于移栽。根數越多，根長適宜且粗壯的，移栽成活率高（表3）。因此綜合考慮，在改良的1/2MS培養基中，NAA濃度在0～0.10 mg/L范圍內，幼苗生根數隨著NAA濃度升高而增加；當NAA濃度大于0.10 mg/L時，生根數反而隨著NAA濃度的升高而減少；蓬蘽懸鉤子適宜的生根培養基為1/2MS+NAA 0.10～0.15 mg/L。

2.4 煉苗移栽

組培苗長期生長在光照、溫度和濕度等相對適宜和穩定的環境中，體表幾乎沒有什么保護組織，如果直接移栽到外界環境中，因其本身適應性差，再加上環境變化較大，很難成活。因此需要進行適當的“煉苗”，使其能逐步適應外界的環境變化，提高成活率。不同的煉苗時間處理下組培苗的移栽成活率差異顯著。當煉苗時間為3 d時，可能由于組培苗木質化程度低，仍處于“異養”狀態，因此較難適應瓶外的環境，從而使成活率大大降低；當煉苗時間為10 d時，組培苗雖然已經達到“異養”狀態，但是培養基已受到外界有菌環境的污染，且根部培養基干燥，較難清洗干凈，殘留的營養容易引起移栽苗爛根死亡，使成活率降低；而煉苗時間為7 d時，組培苗已經完成馴化且培養基較易清洗干凈，移栽苗的成活率最高，可達98%（表4）。

2.5 當年苗木生長發育狀況調查

只有將組培苗進行圃地栽培，才能達到苗木繁育的最終目的。5月中旬將苗移栽到大地，此時氣溫和地溫等均較低，不利于根系的生長；6月中旬氣溫和地溫都有所上升，苗木生長較好；而7月中旬移栽苗木時，苗的整體生長期大大縮減。因此從平均分蘗數、平均莖粗、平均成熟高度、平均生長高度等幾個方面綜合考慮，組培苗進行圃地栽培時，以6月中旬移栽入大地較為適宜（表5）。

3 結論與討論

本研究以蓬蘽懸鉤子嫩梢為試驗材料，將帶腋芽莖段用75%乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒10 min，最后，接種到MS培養基上。最佳的增殖培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，其次為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；進行壯苗培養時，最適宜的培養基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA或者MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；瓶內生根最適培養基為改良的1/2MS+010～0.15 mg/L NAA，生根率為100%，平均根數最多可達11.21條/株，平均根長最長可達4.86 cm，根粗健壯。對組培苗當年植株生長發育情況調查發現，以6月中旬移栽到大田的生長發育狀態最佳。

蓬蘽懸鉤子因其具有較高營養保健價值，日益受到人們的青睞，對其進行組織培養快繁技術研究，可實現野生資源的最大化利用。本研究以蓬蘽懸鉤子帶腋芽莖段為試材，采用不同培養基、植物激素及其濃度組合，建立了穩定的離體快繁體系，為今后組培苗的工廠化生產提供技術指導，更重要的是可對優質品種的推廣利用提供經驗借鑒。

參考文獻：

[1]趙偉偉，李愛民，張正海，等. 野生樹莓蓬蘽懸鉤子光合特性研究[J]. 中國果樹，2014（1）：28-30.

[2]和加衛，唐開學，楊靜全，等. 云南省懸鉤子屬藥用植物資源研究[J]. 中草藥，2005，36（7）：1078-1081.

[3]解瑞彬，李秋菊，曹媛媛，等. 樹莓的組織培養快繁研究[J]. 天津農業科學，2009，15（3）：23-25.