油葵嫁接及其在離體培養和轉基因中的應用

焦展　安勝軍　邵鐵梅

摘要：以油葵為試材，用實生苗砧木和接穗進行嫁接試驗，比較斜接、插接、劈接和合接4種方法以及不同品種、苗齡的砧木、嫁接后綁縛方法的嫁接效果，并試驗離體培養的轉基因接穗嫁接效果。結果表明，劈接法最為適宜，砧木選用在1對真葉期和2對真葉期的恢復系嫁接效果較好；嫁接后用棉線繩綁縛，濕報紙包裹，最后用嫁接夾固定，實生嫁接成活率可達80%以上。采用子葉節侵染和去1片子葉侵染2種轉基因方法，獲得轉基因陽性接穗經壯苗培養后嫁接，得到完整植株的成活率可達60%和81.11%，明顯高于用生根移栽的方法和直接嫁接的方法，而且嫁接植株能夠正常開花結籽。從結果可以看出，劈接法為油葵最適宜的嫁接方法，可顯著提高離體培養和轉基因研究中獲得完整植株的概率，且能夠應用于油葵基因工程育種研究中。

關鍵詞：油葵；嫁接；劈接法；離體培養；轉基因

中圖分類號： S565.504.3；S339.4+5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0143-04

嫁接技術是一門應用廣泛的園藝技術，也是近年來基因工程育種研究領域的常用技術之一[1-2]。油葵即油用向日葵（Helianthus annuus L.），是我國乃至世界重要的油料作物。向日葵離體培養和轉基因方面的研究已有幾十年的歷程[3]。通過基因轉化將有益基因導入作物是抗病、抗蟲和抗逆育種的有效手段，同時也是轉基因植物生產藥用蛋白不可缺少的重要基礎[4-6]。然而，多年來在向日葵離體培養和轉基因研究中發現，油葵離體培養和遺傳轉化研究中常遇到諸如離體生根困難，移栽成活率低，再生或轉化植株易早花敗育、結實困難等問題[7-8]。這些問題已成為該植物轉基因研究中獲得完整植株并繁育后代的嚴重障礙[3]。已有研究指出，利用嫁接可獲得完整轉基因植株[4，9-13]。但是關于油葵嫁接的具體技術方面的研究還未見報道。本試驗詳述了一種油葵嫁接新技術，可有效解決這一難題，為油葵離體培養轉基因研究中獲得完整植株開辟了新的途徑。同時，該技術也適用于其他栽培研究方面，能夠為向日葵遠緣雜交、品種改良等研究提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 本試驗以羅馬尼亞“精選”恢復系為試材，進行離體培養和轉基因技術研究。在嫁接試驗中砧木選用羅馬尼亞“精選”恢復系（種子由河北省半干旱研究中心提供）和雜交種“矮大頭”（從種子公司購買），接穗選用 “精選”恢復系及其離體培養材料。

1.1.2 培養基 種子萌發培養基MS+0.1 mg/L 6-BA，去1片子葉離體培養基：MS+0.1 mg/L 6-BA。子葉節再生培養基MS+B5有機物+肌醇0.1 g/L+KNO3 5 g/L+水解酪蛋白0.5 g/L+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.07 mg/L+TIBA 0.02 mg/L+苯丙氨酸5.0 mg/L+AgNO3 7.0 mg/L。培養基中含蔗糖30 g/L，瓊脂7.0 g/L，pH值5.8。

1.1.3 試劑 所用試劑購自上海生工公司；培養土為北京大漢公司培養土，與蛭石1 ∶ 1混合。

1.2 方法

1.2.1 油葵的離體培養和轉基因 油葵去1片子葉再生和轉化：油葵種子消毒后，放于培養基中萌發3～4 d，用解剖刀去掉1片子葉并劃傷生長點部位。將制備好的外植體放于預先制備好的農桿菌（含有胰島素基因）懸菌液中浸泡0.5～1 h，共培養3 d。然后轉入含卡那霉素（Kan） 50 mg/L和頭孢霉素（Cef） 250 mg/L篩選培養基中篩選3周得到抗性芽，每周更換1次培養基。最后取葉片經PCR檢測，結果為陽性的抗性芽用于嫁接。

油葵子葉節的離體再生和轉化：油葵種子消毒后，置于無菌瓶中，搖床振蕩培養6 h（135 r/min，27 ℃）。在超凈工作臺上用解剖刀將種子2片子葉分開，適當去除1 mm左右胚軸，并確保去除生長點和幼芽，最后切除子葉遠離生長點的1/2部分，剩余部分作為離體再生的外植體。侵染方法同上。侵染后3 d轉入含Cef 250 mg/L的再生培養基中生長10 d，然后轉入含Kan 50 mg/L 和Cef 250 mg/L篩選培養基中篩選3周，每周更換1次培養基。最后將得到的抗性芽取葉片作PCR檢測，結果為陽性的用于嫁接。

轉基因方法由農桿菌介導，使用的菌株為含有胰島素基因的LBA4404。PCR檢測所用引物序列為：上游引物5′-CGGGGTACCTCGTCTAAATTTCAGCCTATCGACG-3′；下游引物5′-CGAGCTCTTAGTTGCAGTAATTTTCTAG-3′。

1.2.2 接穗和砧木的選擇 接穗的準備方法：挑選健壯種子播種，待幼苗長至1對真葉時取上胚軸以上部位作為接穗供嫁接使用。離體培養的再生芽和轉基因試驗中的陽性芽也作為接穗使用。

砧木的準備方法：將油葵種子（品種為羅馬尼亞“精選”恢復系和雜交種“矮大頭）用濕播法播種于10 cm營養缽里，每穴1株。用子葉期至2對真葉期的幼苗在子葉節處、上胚軸處或1對真葉和2對真葉的莖節之間切去上半部位丟棄，余下部分作為砧木。

1.2.3 嫁接方法的比較 本試驗比較4種嫁接方法（圖1），砧木切割部位均為第1對真葉以上2.0～3.0 cm處，并將以上部位除去，4種嫁接方法分別為：（1）斜接法，挑選莖粗相近的接穗和砧木，在接穗的下端和砧木的上端均斜向削出 10 cm 左右等長的平整斜面，將兩斜面對接整齊。（2）插接法，取尖銳竹簽從砧木橫截面上插孔，將接穗下端削成適合砧木凹槽和深度的形狀，插入砧木孔中。（3）劈接法，用鋒利刀片于砧木莖中間豎直劈開1.0 cm左右的切口；在接穗下端削出兩面各1.0 cm長的斜面，將接穗插入切開的砧木，使二者的形成層部分對齊。（4）合接法[14]，自上而下將砧木的莖削成平滑的斜面，斜面長度為 1.0～1.5 cm，自斜面順莖中軸垂直將莖切開至斜面底部，切口深度0.5～1.0 cm。將接穗削成與砧木同樣大小的斜面并沿中軸垂直切開，刀口深度 0.5～1.0 cm。將砧木和接穗內切面部位的莖相互交錯插至切面底部。統計嫁接后5、10 d成活率，每種嫁接方法試驗30株，重復3次。

1.2.4 砧木不同苗齡和不同品種的比較 砧木不同品種和苗齡的試驗采用6個處理，分別為子葉期恢復系、1對真葉期恢復系、2對真葉期恢復系、子葉期“矮大頭”、1對真葉期“矮大頭”和2對真葉期“矮大頭”。接穗均為恢復系實生植株的1對真葉期的頂芽。每處理30株，重復3次，嫁接后10 d統計成活率。

1.2.5 嫁接綁縛和嫁接后的管理 嫁接綁縛的4種方法相比較：（1）用棉線繩綁縛接口，并用保鮮膜保濕；（2）用濕報紙包裹接口并用嫁接夾固定；（3）用濕報紙包裹接口并用棉線繩綁縛固定；（4）用濕報紙包裹、棉線繩綁縛，最后用嫁接夾固定。每處理30株，重復3次。嫁接后，用保鮮袋覆蓋植株，并保證每天開袋透氣2次，每次10 min左右，并噴水保濕。5 d 后拆除綁縛和嫁接夾，但仍需注意保濕，循序漸進摘除保濕袋，7～10 d后檢查嫁接成活。14 d后將嫁接成活株移至大盆。

1.3 數據統計分析

嫁接后5～10 d觀察傷口愈合情況和生長狀態，統計嫁接苗成活率，計算平均值。數據用DPS進行統計分析，方法為鄧肯氏新復極差法，顯著水平為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 不同嫁接方法的嫁接效果

本試驗為更科學地比較4種嫁接方法的優劣，用“精選”恢復系實生苗接穗進行嫁接試驗。嫁接后5 d成活率分別為：斜接法和劈接法成活率較高，分別為84.44%和88.89%，而插接法和合接法成活率較低，分別為60.00%和62.22%。而嫁接后10 d統計數據顯示劈接法成活率最高（82.22%），是油葵嫁接最理想的方法，其次為斜接法62.22%，而插接法和合接法成活率較低，分別為33.33%和37.78%（圖2）。通過與非嫁接苗的生長狀況進行比較，嫁接后10 d，嫁接苗長勢明顯偏弱，生長速度緩慢，但經過20 d左右的生長，砧木和接穗結合良好后，嫁接苗會迅速生長，最終與非嫁接苗相比，莖肝略細，花盤略小，可正常結實，籽粒飽滿。

2.2 砧木品種和苗齡對嫁接的影響

本嫁接試驗用“精選”恢復系作為接穗，比較了同品種砧木和雜交種“矮大頭”2種砧木對嫁接的影響。結果表明，“精選”恢復系的嫁接成活率明顯高于“矮大頭”的嫁接成活

率，說明砧木“矮大頭”與接穗的親和力較差。而比較不同苗齡對嫁接的影響，1對真葉期和2對真葉期的恢復系砧木嫁接效果最好，成活率均高于80%，且兩者沒有顯著性差異。因此，本研究中其他試驗均選用1對至2對真葉期的恢復系實生苗作為嫁接砧木使用（圖3）。

2.3 綁縛方法對嫁接成活率的影響

試驗結果表明，用棉線繩綁縛并用保鮮膜保濕的方法在4種方法中成活率最低，僅為11.11%；而報紙保濕并用嫁接夾固定和報紙保濕用棉線繩固定2種方法的成活率沒有顯著性差異，分別為38.89%和42.22%；成活率最高的綁縛方法為，用棉線繩綁縛，然后用報紙保濕最后用嫁接夾再次固定。這種方法嫁接成活率顯著高于其他方法，成活率為84.44%（圖4）。

2.4 離體培養再生苗或轉基因苗的嫁接

2.4.1 離體培養再生芽或轉基因芽的獲得 侵染后的子葉節外植體3～5 d開始吸水膨脹，10 d左右可用肉眼觀察到在子葉節處有膨脹的芽點。多數情況下芽點出現在子葉節處，后期分化出再生芽。去1片子葉實生株經農桿菌侵染后，10 d 后也可見新的幼芽萌發。通過2種方法，并經過3次抗生素篩選，均可得到抗性芽，PCR結果如圖5所示。將陽性芽作為接穗嫁接于砧木上，成活后即可初步得到完整的轉基因植株。

2.4.2 離體培養轉基因芽的嫁接 預試驗研究中發現，通過子葉節和去1片子葉的轉化方法，獲得轉基因芽后進行生根移栽以期獲得完整植株，成活率相當低（10%和17.78%）。即使獲得完整植株，植株瘦弱，早花現象嚴重，幾乎不能獲得種子。依靠嫁接技術獲得完整植株，成活率可達40%和 56.67%。而嫁接前，對接穗進行壯苗培養，將轉基因陽性芽移至不含Kan的培養基中，并在培養基中添加少量的PP333，培養7 d，然后開瓶鍛煉3 d。結果表明，經壯苗培養的接穗嫁接成活率明顯高于直接嫁接的接穗，成活率可達60%和 81.11%（圖6）。

由子葉節和去1片子葉2種方法轉化得到的轉基因芽，經過壯苗培養和開瓶鍛煉，作為接穗，采用劈接法嫁接于實生苗砧木，10 d后接口愈合良好，20 d后莖稈變粗生長迅速，35 d 后可開花，最終能夠獲得種子（圖7）。

3 討論與結論

本試驗系統研究了油葵嫁接技術，并將其應用于轉基因研究中獲得了完整的轉基因植株，并能夠開花結籽。嫁接技術能夠提高離體培養轉基因苗的成活率，這和前人研究結果[15-16]一致。研究結果顯示，劈接法為油葵最適宜的嫁接方法。這與王彥霞等、吳慎杰等在棉花上的結果[14，16]不同。原因可能與植物本身生長特性和生理狀態相關。棉花幼苗的莖

較粗較硬，而油葵幼苗的莖較為纖細柔嫩，因此，適宜棉花的合接法對于油葵來說，操作不便，操作過程過長會造成莖的失水萎蔫，不利于接口愈合。而劈接法操作簡便，且更為直觀，容易使接口形成層對準，因而更利于接口愈合[17-18]。但有研究指出，嫁接成活后砧木和接穗可能會相互影響，還有可能發生遺傳物質的轉移[1，19-20]，本研究未做探討，有待進一步深入研究。

需要注意的是，在嫁接傷口愈合前，砧木和接穗都靠自身的養分積累提供營養物質[1，19]。因此，砧木和接穗在嫁接前需要去除多余的葉片，以減少養分的消耗。研究中比較了4種不同的嫁接后綁縛方式。棉線繩、保鮮膜和嫁接夾都具有一定的固定功能，保鮮膜和報紙則用來對接口進行保濕。保鮮膜保濕效果較好，但容易造成接口處通氣不良，接口易壞死。而棉線繩綁縛并用濕報紙保濕，既能起到良好地固定作用使接口較好的接合，又能使接口處于濕潤狀態，由于每天噴水并開袋透氣，所以保濕效果良好，接口愈合快。另外，嫁接夾不可過緊，否則影響接口養分運輸，造成結合不良。嫁接時可將嫁接夾的環放松一點，以能夠固定嫁接綁縛物并且莖稈接口處不變形為準，可達到良好的效果。

該嫁接技術可顯著提高離體培養和轉基因研究中獲得完整植株的概率，且嫁接后的轉基因植株能夠正常開花結實。該方法可應用于油葵基因工程育種研究中。

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