白僵菌孢子懸液添加促進劑對茶毛蟲幼蟲侵染的對比試驗

李靜　馬媛　趙洪

摘要：將15%乙醇、2%吐溫、2.5%肥皂水分別添加進5個濃度梯度的白僵菌孢子懸液進行對比試驗。結果表明：添加促進劑能使茶毛蟲幼蟲半數死亡時間提前，添加15%乙醇提前10 d、添加2%吐溫提前7 d、添加2.5%肥皂水提前7 d。根據以上結果可知，對比添加乙醇最好，但考慮添加的量和成本問題，添加肥皂水最經濟。

關鍵詞：白僵菌；孢子；茶毛蟲；半數死亡時間

中圖分類號： S435.711 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0170-02

白僵菌（Beauveria bassiana）是昆蟲病原真菌之一，遍布全世界，寄主范圍廣，是用于生物防治的真菌，近年來較多應用在蝗蟲、松毛蟲、玉米螟等重大害蟲的防治上[1]。白僵菌殺蟲機理是其孢子接觸害蟲后產生芽管，牙管分泌一種溶解幾丁酶，溶解蟲體表面的幾丁質后進入蟲，牙管不斷生長伸入蟲體內壁，并伸長變為菌絲，不但吸取蟲體的水分和養分而不斷生長、伸長、分枝、增殖，擾亂蟲體的新陳代謝，直到整個蟲體充滿菌絲而死亡[2]。采用白僵菌制成的殺蟲劑對人、畜無毒，對作物安全，無殘留、無污染，對鱗翅目、鞘翅目、同翅目等昆蟲有毒害作用，是一類比較理想的綠色環保型生物殺蟲劑[3-4]。

茶毛蟲是茶樹的主要害蟲之一，主要危害茶樹的是幼蟲，茶毛蟲的幼蟲取食是茶樹的葉片，大量發生時將茶樹芽葉、嫩梢、樹皮咀食殆盡，嚴重影響茶葉的產量和茶樹的長勢[5]。長期以來茶毛蟲的發生產生危害時還是以化學防治為主，農藥殘留嚴重影響和制約了茶葉的產業發展，尋找一種高效、無污染、無農藥殘留、無副作用的新技術防控茶毛蟲對茶葉的危害，是目前茶樹病蟲害防治中的重要工作之一。

在白僵菌的前期研究中發現，白僵菌侵染茶毛蟲到致死所需要的時間較長，采用紫外線誘變，篩選優良菌株效果不理想。白僵菌殺蟲見效慢，是白僵菌用作生物農藥的瓶頸，因此本研究采用在白僵菌孢子懸液里添加促進劑，以期縮短侵染時間，提高死亡率，為白僵菌對茶毛蟲的生物防治提供了一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 白僵菌菌由黔南民族師范學院生命科學系微生物實驗室從白僵蠶分離得到。

1.1.2 供試蟲源 在貴州省都勻毛尖茶茶園基地采集到茶毛蟲1齡幼蟲。

1.2 方法

1.2.1 昆蟲飼養 采集1齡幼蟲，放入廣口瓶中，瓶口用紗布封口，紗布上放3層濕面紗，瓶內放蘸濕的棉花保濕，每瓶加入3～5張鮮葉為飼料，瓶內葉片大多被食用時，及時去除殘片，加入新葉。培養瓶放在溫度23.5 ℃左右、相對濕度70%～80%、光—暗周期12 h—12 h的光照培養箱中培養[6]，培養到3齡幼蟲，用于后面的試驗。

1.2.2 菌種活化 采用滅菌PDA培養基上，在超凈工作臺中，接種白僵菌在平板培養基中，將平板培養基放入26 ℃的恒溫箱中進行培養；培養7～10 d后，白僵菌長滿整個平板后備用。

1.2.3 孢子懸液的制備 在長滿白僵菌的平板上加入10 mL 的無菌水，用無菌棉花過濾，濾液用5 000 r/min的離心機清洗3次。采用平板計數法計數清洗后的孢子懸液濃度為297×108 CFU/mL，采用濃度梯度法配制2.97×107、2.97×106、2.97×104、2.97×102 CFU/mL共5個濃度梯度的孢子懸液。

1.2.4 孢子懸液的侵染方法 取6個直徑為120 mm的培養皿，分別放入20頭茶毛蟲3齡幼蟲，在飼養方法不變的條件下，利用注射器分別用以上5種濃度梯度的白僵菌孢子懸液噴水到蟲體上，并用無菌水作空白對照，每天噴霧1次，連續噴霧3 d，然后觀察茶毛蟲的活動狀況。

1.2.5 添加促進劑在孢子懸液的方法 按15%乙醇、2%吐溫、2.5%肥皂水，分別添加進5個濃度梯度的白僵菌孢子懸液，用以上孢子懸液的侵染方法感染茶毛蟲，觀察茶毛蟲的死亡情況。

2 結果與分析

2.1 茶毛蟲幼蟲（茶毛幼）形態特點及生活習性觀察

2.1.1 茶毛幼形態特點 1齡幼蟲體長為2 mm左右，淡黃褐色，體被褐色短毛和黃色長毛，到5～7齡時，蟲體長 18～26 mm，體色均為黃褐色。

2.1.2 茶毛幼生活習性 茶毛蟲幼蟲共有6～7個齡期，每年發生3～4代[7]。（1）群集性：1～2齡幼蟲時，群集性強，幾十頭至百余頭幼蟲聚集在茶葉的背面取食。3齡幼蟲開始分群，10頭至幾十頭不等群集，移動時，1頭帶頭遷移，后面的緊追不舍。人為地將它們在同一飼養裝置中分散，約20 min后它們又群聚在一起。到5齡幼蟲以后，個體各自分散行動。（2）取食性：1～2齡幼蟲聚集在茶葉的背面，僅啃食葉的下表皮和葉肉，使葉片呈薄膜狀，3齡幼蟲，開始葉片全食，造成葉片大面積缺口，到5齡幼蟲以后，各自尋找食物，葉片全食，吃光1張，再移1張。（3）取食時間：在野外茶毛幼在08：00左右開始取食，在10：00 左右停止，中途因為天氣熱，就爬到周圍較陰涼的雜草中躲藏；下午在17：00左右，出現在茶葉上取食。在室內培養，一般08：00—11：00取食，中途到茶葉背面躲藏，不取食，到16：00—19：00取食，晚上也到背面躲藏，不取食。

2.2 不同濃度孢子懸液的白僵菌對茶毛幼觸殺的影響

采用5個濃度梯度的孢子懸液和1個空白對照，對每組20頭茶毛幼進行噴灑觸殺，15 d后有蟲死亡。

由表1和圖1可知，白僵菌孢子濃度在2.97×108 CFU/mL時，茶毛幼半數致死時間最短，需要20 d，隨著孢子濃度降低，半數死亡時間延長，致死率也逐漸降低。白僵菌濃度在2.97×104、2.97×102 CFU/mL時，死亡率達不到100%。

2.3 不同濃度白僵菌孢子懸液添加15%乙醇對茶毛幼觸殺的影響

添加15%乙醇到5個濃度梯度的孢子懸液和15%乙醇作為空白對照，對每組20條茶毛幼進行噴灑觸殺，2 d后有蟲死亡。

根據表1和表2、圖2的數據對比，添加15%乙醇茶毛幼殺蟲半數致死時間提前了10 d，添加乙醇的白僵菌孢子隨著濃度的降低需要的半數死亡時間延長；在5～8 d時，茶毛幼死亡數都為0，說明前期茶毛幼死亡是由乙醇導致的。

2.4 不同濃度白僵菌孢子懸液添加2%吐溫對茶毛幼觸殺的影響

添加2%吐溫到5個濃度梯度的孢子懸液和2%吐溫作為空白對照，對每組20條茶毛幼進行噴灑觸殺，11 d后有蟲死亡。

根據表3、圖3和表1的數據對比，添加2%吐溫白僵菌孢子懸液茶毛幼殺蟲半數致死時間提前了7 d，添加吐溫的白僵菌孢子隨著濃度的降低半數致死時間延長；茶毛幼死亡時間集中在15～16 d，死亡較為集中整齊。

2.5 不同濃度白僵菌孢子懸液添加2.5%肥皂水對茶毛幼觸殺的影響

添加2.5%肥皂水到5個濃度梯度的孢子懸液和2.5%肥皂水作為空白對照，對每組20頭茶毛幼進行噴灑觸殺，12 d 后有蟲死亡。

根據表4、圖4和表1的數據對比，添加2.5%肥皂水白僵菌孢子懸液茶致死毛幼殺蟲半數時間提前了7 d，隨著孢子濃度的降低，致死率也逐漸降低。茶毛幼死亡時間集中在15～18 d。

3 結論與討論

3.1 結論

茶毛蟲具有年幼時聚集在一起、成蟲時分開的特性，取食時具有早晚陰涼時取食、中午為避開炎熱躲藏起來的特性。

茶毛幼隨著白僵菌孢子濃度降低需要的半數死亡時間逐漸延長；并隨著孢子濃度的降低，致死率也逐漸降低。

添加促進劑能使茶毛幼半數致死時間提前，添加15%乙醇提前10 d、添加2%吐溫提前了7 d、添加2.5%吐溫提前了7 d。根據以上對比添加乙醇最好，但考慮添加的量和成本問題，添加肥皂水最經濟。

白僵菌孢子濃度在2.97×108、2.97×107、2.97×106 CFU/mL 時，茶毛幼死亡率均為100%，2.97×108、297×107 CFU/mL侵染茶毛幼差異明顯，建議孢子濃度在2.97×107個/mL較為適宜。

3.2 討論

添加促進劑15%乙醇2 d就能使茶毛幼死亡，與未添加的相比時間提前13 d，但在5～8 d時死亡率都為0，根據空白對照可知，15%乙醇就可以使茶毛幼死亡，所以確定白僵菌致死茶毛幼需要的時間是實際提前9 d，比不添加促進的白僵菌提前6 d，促進作用還是很明顯。

添加乙醇有促進白僵菌致死茶毛幼的作用，可能是因為乙醇有滲透作用，促進白僵菌孢子進入茶毛幼基體內，白僵菌在蟲體內生長；而吐溫和肥皂水都是表面活性劑，由于白僵菌孢子懸液進入蟲體較困難，一是蟲體表面被毛，二是表面有活性張力，而吐溫和肥皂水都有降低表面活性張力的作用，促進白僵菌孢子進入蟲體，白僵菌在蟲體萌發生長，達到致死茶毛幼的作用，促進作用較乙醇差一些。

參考文獻：

[1]譚濟才. 茶樹病蟲防治學[M]. 北京：中國農業出版社，2002.

[2]季香云，楊長舉. 白僵菌的致病性與應用[J]. 中國生物防治，2003，19（2）：82-85.

[3]林海萍，韓正敏，張 昕，等. 球孢白僵菌研究現狀及提高其殺蟲效果展望[J]. 浙江林學院學報，2006，23（5）：575-580.

[4]徐婉清. 白僵菌生物特性及防治研究[J]. 綠色科技，2010（5）：122-123.

[5]姚 渭. 茶毛蟲產卵規律的研究[J]. 西北農業大學學報，1993，23（3）：224-229.

[6]唐美君，殷坤山，郭華偉，等. 茶毛蟲實驗種群生命表[J]. 植物保護，2012，38（2）：127-129.

[7]韋玲長. 夏茶期間茶樹主要害蟲的發生與防治[J]. 臨滄科技，2003（4）：41.