金蓮花種子無菌播種及離體培養技術

胡海英　李瑜

摘要：通過金蓮花種子無菌播種、離體培養技術的研究，初步建立金蓮花離體培養的技術體系和方法，為其種質資源的保護和利用提供前期的技術基礎。以金蓮花種子為外植體，篩選出適宜金蓮花無菌播種發芽、離體培養的培養基配方。結果表明：金蓮花種子用100 mg/L GA3冷浸4 d效果最佳，其發芽率為92.67%；用無毒級殺菌消毒劑愛力克配制成 2 500 mg/L，與75%乙醇配合消毒20 min效果最佳；適宜金蓮花種子無菌播種培養基配方為MS+0.1 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA；適宜金蓮花試管苗叢生芽增殖的培養基配方為1/2MS+ 0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L KT+05 mg/L IBA+100 mg/L PVP+40 mg/L維生素C；適宜金蓮花試管苗壯苗生長的培養基為1/2MS+0.5 mg/L NAA +40 mg/L 維生素C+100 mg/L PVP+0.5%活性炭。

關鍵詞：金蓮花；種子；無菌播種；組織培養

中圖分類號： S567.23+9.043 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0230-03

金蓮花（Trollius chinensis Bunge.）別稱旱荷、旱蓮花、寒荷、陸地蓮等，為毛茛科金蓮花屬，屬于一年生或多年生草本植物，喜冷涼濕潤環境，多生長在海拔1 800 m以上的高山草甸或疏林地帶。金蓮花在我國分布較為廣泛，其主產地在河北塞罕壩上周邊地區的沿壩地帶，在寧夏主要零星分布于六盤山等地區。金蓮花植株秀麗、花色金黃，是優良的花壇、花鏡和盆花材料[1-3]；同時，金銀花花朵有極高的藥用價值，可入藥或制茶[2-6]。目前，國內有關金蓮花的研究多集中于金蓮花藥理成分提取、分離、鑒定和醫藥制劑與質量控制方面[7]，如劉麗娟等對長瓣金蓮花[8]、黃文哲等對短瓣金蓮花[9]的莖葉化學成分進行了研究，葉紹明等通過研究建立了關于金蓮花有效成分的提取工藝體系[10]。在金蓮花的人工栽培、養護管理方面，陳智卿等進行了一系列較為詳盡的研究，認為通過實生播種進行金蓮花種苗培育，其幼苗死亡率高達70%～80%，且幼苗期栽培管理較難，難以達到迅速培育優質種苗的目的[1-2，11]；由于金蓮花的休眠特性，使其自然繁殖系數低，幼苗死亡率高。在金蓮花組織培養的研究方面，國內有零星相關報道，楊玉芳等以山西金蓮花種子為材料建立了金蓮花離體培養體系，但是金蓮花除菌環節較困難，污染嚴重，繁殖系數低[12]。因此，解決金蓮花發育遲緩、無菌苗生長緩慢、繼代不穩定等問題仍是當前重要的研究工作。本研究在藥用植物組織培養研究的基礎上，通過不同種類、不同濃度細胞分裂素、生長素的搭配使用，選擇適宜的種子無菌播種、增殖培養的培養基配方，初步建立金蓮花離體培養技術和方法，以期為金蓮花種質資源保護與利用提供前期的試驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

金蓮花種子，由寧夏隆德縣金蓮花示范種植基地提供，引種于河北壩上地區，別稱壩上金蓮花。經干燥、挑揀雜物等處理后，置于牛皮紙袋中，于4 ℃冰箱冷藏保存。

在無菌播種前解除種子休眠，先將種子清洗后浸沒于100 mg/L GA3溶液中，于4 ℃低溫冷藏4 d（該條件發芽率可達92.67%）后進行無菌消毒。培養基采用MS基本培養基[13-15]，其中含6 g/L瓊脂、30 g/L蔗糖，pH值5.8。添加的植物激素有細胞分裂素6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、噻苯?。═DZ）；生長素α-萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IBA）?？寡趸瘎榫垡蚁┻量┩橥≒VP）、維生素C。吸附劑為活性炭。

消毒液選用上海宇涵生物科技公司生產的新一代無毒級殺菌消毒劑愛立克，配制成2 500 mg/L濃度備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同消毒時間對金蓮花種子無菌萌發的影響 將清洗并解除休眠的種子置于超凈工作臺上，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用無菌水清洗3次，再用2 500 mg/L消毒液分別浸泡15、20、25 min，最后用無菌水清洗3次，用無菌濾紙吸干水分后接種到培養基中，觀察種子的發芽情況、污染情況，統計其發芽率、污染率。培養條件：光照時間8 h/d，光照度為 1 000 lx，培養溫度為（25±1） ℃。

1.2.2 金蓮花種子無菌接種培養基的篩選 用以上篩選出的打破休眠并用最佳無菌消毒方法處理的種子后，將種子接種在不同配方的培養基上。以污染率、發芽率為指標，篩選種子無菌播種最適培養基配方。培養條件：光照時間8 h/d，光照度1 000 lx，培養溫度（25±1） ℃。

1.2.3 金蓮花試管苗叢生芽增殖培養基的篩選 將金蓮花試管苗分成帶部分根、莖、葉的材料，分別接種到含不同濃度6-BA、TDZ、IBA的增殖培養基中（配方詳見表2），觀察其從生芽的分化情況。培養條件：光照時間8 h/d，光照度 2 000 lx，培養溫度（25±1） ℃。

1.2.4 金蓮花試管苗壯苗生根培養基的篩選 以金蓮花試管苗為材料，分別接種到含不同濃度的TDZ、NAA、IBA的壯苗生根培養基中（培養基配方見表3），觀察其生長及生根情況。培養條件：光照時間8 h/d，光照度2 000 lx，培養溫度（25±1） ℃。

1.3 數據統計

本研究中用到的相關公式如下：發芽率=（發芽的種子數/試驗種子總數）×100%；污染率=（污染的種子數/試驗種子總數）×100%；成苗率=（發芽種子形成幼苗數/發芽的種子數）×100%；增殖系數= （再生叢生芽數/接種數）×100%。

統計分析所得數據采用SPSS 19.0軟件進行標準誤及方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對種子無菌萌發的影響

經種子休眠解除處理后，對金蓮花種子進行無菌消毒處理，由表4可以看出，滅菌時間不同，消毒效果不同，即污染率不同。

消毒時間為15 min，接種3～7 d后，種子表面長出霉菌，顏色為白色、黑色居多且菌毛較長，形成較大的菌圈，培養基表面形成1層墨綠色的菌層，種子材料全部被污染，無發芽。延長滅菌時間至20 min，污染率為21.47%，發芽率可達50%。滅菌時間延長至25 min時，接種3～7 d后，部分培養基會輕微泛黃，發芽率低。結果說明，滅菌時間過長則會抵制種子活性，影響種子發芽，因此選用2 500 mg/L消毒劑愛立克結合75%乙醇對金蓮花種子滅菌處理20 min，可以達到較好的消毒效果。

2.2 不同激素配比對金蓮花種子無菌發芽效果的影響

不同種類、濃度配比的細胞分裂素、生長素可以直接影響金蓮花種子的無菌發芽效果。從表5可以看出，選用含 0.05～0.10 mg/L TDZ培養基進行金蓮花無菌播種，與含有NAA、6-BA植物激素的培養基相比，種子的發芽率、成苗率相對較高，而且發芽時間也較其他培養基快4～8 d。從發芽率、成苗率、發芽時間的比較可知，選用培養基MS+0.1 mg/L TDZ +0.5 mg/L IBA進行無菌播種，其種子發芽率為51%，成苗率達50%，較其他培養基效果明顯。由此可知，MS+0.1 mg/L TDZ +0.5 mg/L IBA培養基適合用于金蓮花種子的無菌發芽培養（圖1）。

2.3 不同激素配比對金蓮花試管苗叢生芽增殖的影響

從表6可以看出，增殖培養20 d后，各培養基金蓮花從生芽的增殖系數有明顯差異。經方差分析可知，金蓮花在B6增殖培養基中增殖系數顯著高于其他培養基，接種后長出新生芽的時間較短，約為21 d，且增殖叢生芽數多、生長健壯。在本研究中，光照培養一段時間后，材料容易褐化。有研究報道，褐變在植物組織培養中普遍存在，不同植物可采用不同的方法進行預防和控制[14]。筆者發現，在培養基中加入PVP、活性炭可有效防止褐變的發生。

2.4 不同激素配比對金蓮花試管苗壯苗生根培養的影響

不同激素配比對金蓮花試管苗生長影響不一，在添加不同生長素的培養基中誘導獲得的不定根粗而短，且葉片邊緣伸展程度大。由于試驗中添加了活性炭，葉片、莖部沒有褐化現象，且明顯促進了生根。未添加生長素的培養基中誘導獲得的不定根數量少、植株矮小、生長緩慢，說明生長素，尤其是NAA有利于金蓮花不定根的形成，從而促進試管苗的伸長生長。因此，選用C2（1/2MS+0.5 mg/L NAA+40 mg/L維生素C+100 mg/L PVP+0.5%活性炭）培養基作為金蓮花試管苗壯苗生根培養基（表7）。金蓮花試管苗增殖培養效果見圖2。

3 結論

由本研究結果可知，（1）4 ℃低溫層積結合100 mg/L GA3可以有效打破金蓮花種子的休眠，低溫層積處理4 d效果最佳，種子發芽率可達92.67%。（2）用新一代無毒級殺菌消毒劑愛力克，配制成2 500 mg/L溶液，與75%乙醇配合消毒20min效果最好。（3）細胞分裂素、生長素不同濃度配比影響金蓮花的無菌發芽、增殖生長，適宜金蓮花無菌發芽的培養基為MS+0.1 mg/L TDZ+0.5 mg/L IBA；適宜金蓮花試管苗叢生芽增殖的培養基為1/2MS+0.05 mg/L TDZ+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L IBA+100 mg/L PVP+40 mg/L 維生素C；適宜金蓮花試管苗壯苗、生根的培養基為1/2MS+0.5 mg/L NAA+40 mg/L維生素C +100 mg/L PVP+0.5%活性炭。（4）在培養基中加入維生素C、PVP等抗氧化成分，配合活性炭，并在金蓮花無菌試管苗再生出2～3張葉、培養時間約為18 d時及時對其幼苗進行轉接，可有效避免褐化。

4 討論

4.1 金蓮花種子休眠的解除方法

顧增輝等研究認為，純丙酮配制GA3溶液浸泡種子 4 h 處理金蓮花種子發芽效果最好[4]，與本研究結果一致。但處理后，將種子進行無菌消毒后進行播種時，種子在培養基中的發芽效果與紙床發芽效果差異顯著?？赡苁且驗橛眉儽獙ΨN子處理過后，雖然對種子經過幾次無菌水的清洗，但不排除還留有一定量純丙酮溶液對種子萌發造成的影響，使長出的幼苗不能順利生長成苗。因此，是否用此方法對金蓮花種子進行休眠解除并應用于組織培養還有待于進一步研究。

4.2 不同的無菌消毒方法

在野生花卉引種馴化中，以種子為外植體建立離體培養體系是一條多快好省的途徑，但在建立離體培養技術前的基礎是對外植體進行無菌消毒。在對金蓮花無菌消毒方法中，楊玉芳等采用HgCl2消毒，對種子有一定的毒害作用，造成材料大量污染、發芽率低等問題[12]。在本試驗中，用新型的消毒劑對種子組織毒害小，除能殺死所有細菌繁殖體外，對所有細菌芽孢、病毒、藻類和真菌等均有很強的殺滅作用，但是長時間作用也會對種子產生毒害，從而影響種子萌發。并且外植體污染問題不能根除，也可能與金蓮花本身的野生生存環境有關，金蓮花快速生長期、種子成熟期為多雨季節，多濕、半陰環境有利于微生物的繁衍，其果實為蒴果，采收時蒴果均已開裂，其間繁衍了大量真菌或細菌等微生物，增加了組織培養材料除菌的難度[15-16]。

4.3 金蓮花試管苗發芽、生長緩慢

本研究發現，金蓮花種子的發芽率在有菌環境（培養皿濾紙發芽）、無菌培養基條件下存在一定的差異。前者種子發芽率略高于后者，且發芽時間短（3 d開始發芽），嚴力群等也有過類似報道[5]。但在無菌培養基中，最快6 d開始發芽，可能是無菌培養基含水量高、各種激素配合作用，以及pH值等均是影響金蓮花種子發芽慢的因素，但主導制約因素還待研究。另外，本研究中使用具有細胞分裂素作用的TDZ，能誘導離體培養材料的多種途徑形態發生，比6-BA、KT等細胞分裂素效果明顯。在培養基中加入維生素C、PVP，配合活性炭，并在金蓮花無菌試管苗再生出2～3張葉時（培養時間約為18 d左右），及時對其幼苗進行轉接，可有效避免褐化。盡管綜合應用了以上措施，但金蓮花無菌發芽最快在第6天，且增殖系數最多為1.75，還不能完全達到離體快繁的目標。因此，解決金蓮花試管苗生長緩慢、提高增殖快繁倍數仍是今后的研究重點。

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