凍融及堿性鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗的生理響應

李艷芳　包國章　劉曉婷

摘要：以東苜1號品種苜蓿為試驗材料，在中度堿性鹽脅迫下對其幼苗進行凍融處理，以整株幼苗為試驗對象，研究幼苗體內蛋白質含量、MDA含量、脯氨酸含量、POD活性、SOD活性。結果表明，堿性鹽脅迫下苜蓿幼苗體內產生大量活性氧，MDA含量升高10.83%～46.99%，對幼苗造成傷害，致使蛋白質含量減少1.39%～9.89%，幼苗體內防御機制誘導POD、SOD活性增強以抵抗堿性鹽傷害；在凍融脅迫下，整個凍融周期內脯氨酸、MDA含量、POD活性、SOD活性均呈先升高后降低的趨勢，對-3 ℃較為敏感，與10 ℃相比分別增加了54.94%、76.80%、48.75%、10.80%，具有顯著性差異（P<0.05）；低溫狀態下MDA含量增加，幼苗受傷害的程度加??；凍融及堿性鹽雙重脅迫作用對紫花苜蓿幼苗的傷害更大。在凍融及堿性鹽脅迫下，苜蓿幼苗的各項生理指標發生適應性變化，保證了幼苗的正常生長，表明苜蓿幼苗具有一定耐寒和耐鹽堿能力。

關鍵詞：紫花苜蓿幼苗；凍融；堿性鹽脅迫；耐寒性；耐鹽堿性

中圖分類號： S541+.101 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0278-04

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）以“牧草之王”著稱，是世界上栽培利用最廣泛的豆科牧草。其莖直立，叢生以至平臥，呈四棱形，無毛或微被柔毛，枝葉茂盛，全國各地區均有栽培或呈半野生狀態，生于田邊、路旁、曠野、草原、河岸、溝谷等地。因其植株具有富含蛋白質、產量高、各類家畜喜食等優點，是畜牧業發展中飼料蛋白的重要來源[1]。

我國是世界上土壤鹽漬化較嚴重的國家之一，土壤鹽漬化嚴重影響我國的農業生產和生態環境。我國鹽堿地面積約為4 000萬hm2，約占陸地總面積的25%，僅海岸帶、灘涂的面積就超過667萬hm2[2]。我國東北地區土壤鹽漬化嚴重，且春季凍融是該地區最常見的現象，復合環境脅迫對牧草的要求更高。紫花苜蓿作為優質牧草，具有較強的抗寒、抗鹽堿能力，抗逆性是決定其能否成功生存并發揮優勢生產潛力的重要評價指標[3]。

近年來，關于苜蓿耐鹽性的研究取得了不少成果。龍明秀等研究發現，在鹽脅迫下，紫花苜蓿幼苗葉片和根中抗氧化酶的含量增加；鹽濃度較低時，葉片內抗氧化酶的含量變化不顯著，根的抗氧化能力隨著鹽濃度的升高而下降[1]。周瑞蓮等研究發現，具有抗寒能力的白三葉在經歷凍融過程后，部分恢復正常生長，可見融凍型脅迫引起細胞結冰-融化造成的機械傷害使許多植物無法越冬[4]。王保平等研究發現，堿性鹽對紫花苜蓿的脅迫作用大于中性鹽，各種鹽的作用強度順序為Na2SO4

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用室內培養皿培養試驗法。紫花苜蓿東苜1號種子經7 d培養后得到供試幼苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 種苗選育 挑取飽滿的種子，采用0.1% KMnO4溶液進行消毒，采用直徑為100 mm的培養皿培養幼苗。每個培養皿中放入2層濕潤的濾紙，均勻鋪放100粒種子，加入適量水使種子浸沒，蓋蓋培養。置于光照恒溫培養箱中進行催芽處理，發芽期間可不采用光照。培養至發芽時，采用12 h光照，光照時間溫度為25 ℃，非光照時間溫度為15 ℃。發芽期每天定量滴加4 mL水，分早、中、晚3次添加。培養幼苗至長出第3片子葉時，選取長勢相同的植株進行堿性鹽脅迫處理。

1.2.2 鹽堿處理 處理濃度為0、100 mmol/L，即無脅迫、中度脅迫2個試驗組。

1.2.3 人工模擬凍融試驗 對堿性鹽處理過的試驗組進行凍融處理，處理時間為2 h。溫度分別設置為10、5、0、-3、0、5、10 ℃。設置對照組，即加入鹽堿溶液而不進行凍融的試驗組。根據每個溫度下測定指標所需的樣量對試驗組和對照組進行取樣，每組取3份平行樣，取樣后在冰袋上迅速進行測定試驗。

1.2.4 生理指標測定方法 采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，采用酸性茚三酮比色法[7]測定脯氨酸含量。分別采用SOD、POD試劑盒測定其活性。

1.2.5 數據處理 采用Excel 2007、SPSS 19.0軟件進行數據處理、統計、分析，采用Origin 8.0軟件對各樣的測量數據進行制圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白質含量的變化

本試驗中對照組為純凍融脅迫試驗組，鹽堿組為凍融及堿性鹽復合脅迫組。由圖1可知，經NaHCO3處理后，紫花苜蓿幼苗體內蛋白質的含量比對照組低，減少了1.39%～9.89%?？赡苁怯捎趬A性鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗體內蛋白質合成酶的活性降低或遭到破壞，致使蛋白質合成受阻；或者由于蛋白質分解酶活性增強，導致蛋白質被分解，表明堿性鹽處理導致植物幼苗體內蛋白質含量下降，這與毛桂蓮等對植物耐鹽能力的研究結果[8-9]一致。

在融凍階段，溫度降至5 ℃時，對照組和鹽堿組中苜蓿幼苗體內蛋白質含量均呈下降趨勢，10 ℃與5 ℃相比均有顯著性差異（P<0.05）。

在凍融階段，隨著溫度的回升，苜蓿幼苗體內蛋白質含量均呈上升趨勢。溫度升至0 ℃時，蛋白質含量大幅增加，出現了峰值11.09、10.93 mg/g，分別比0 ℃時增加了18.73%、27.09%，鹽堿組變化較為明顯，與-3 ℃相比均有顯著性差異（P

2.2 MDA含量的變化

由圖2可知，經NaHCO3處理后紫花苜蓿幼苗體內的MDA含量均高于對照組，比對照組增加了10.83%～46.99%?？梢?，經NaHCO3處理后，植物幼苗受到堿性鹽脅迫，膜脂過氧化，MDA含量的增加加劇了膜的損傷。這與尤佳等關于鹽生植物黃花補血種子萌發和幼苗生長對鹽堿脅迫生理響應的研究結果[12]一致，在堿性鹽脅迫下MDA含量升高，MDA含量越高則膜損傷越大。

在融凍階段，對照組與鹽堿組中紫花苜蓿幼苗體內MDA含量的變化趨勢一致。隨著溫度的降低，幼苗體內MDA含量呈上升趨勢。對照組與試驗組在-3 ℃時達到峰值，MDA含量與10、5、0 ℃時均有顯著性差異（P

在凍融階段，對照組與鹽堿組植物幼苗體內的MDA含量呈下降趨勢。溫度回升至10 ℃時，MDA含量比-3 ℃時分別降低了37.83%、42.35%，與-3 ℃時相比有顯著性差異（P

2.3 脯氨酸含量的變化

由圖3可知，堿性鹽處理組的脯氨酸含量均高于對照組，比對照組增加了11.07%～45.32%?？梢?，紫花苜蓿幼苗在堿性鹽脅迫下發生了抗逆性反應，導致體內脯氨酸含量升高。這與胡宗英、高文俊等關于鹽堿脅迫對紫花苜蓿生理特性影響的研究結果[14-15]一致。

由圖3可知，凍融周期內紫花苜蓿幼苗體內的脯氨酸含量呈先上升后下降的趨勢。在融凍階段，對照組和鹽堿組紫花苜蓿幼苗體內的脯氨酸含量均呈上升趨勢，在-3 ℃時出現峰值，分別為116.03、163.01 μg/g，與10 ℃時相比有顯著性差異（P<0.05），下降了25.19%。這與李彥奇等關于低溫脅迫對3種早春短命植物生理生化指標影響的研究結果[16]一致，植物在低溫狀態下通過調節脯氨酸含量減緩低溫傷害。

2.4 SOD活性的變化

由圖4可知，堿性鹽處理后紫花苜蓿幼苗體內SOD活性增強，與對照組相比增強了3.21%～11.01%?？梢?，堿性鹽處理后幼苗迫于堿性鹽脅迫，提高了體內SOD活性。這與劉濱碩等關于羊草在鹽堿脅迫下生理生化響應特征的研究結果[17]一致，在一定鹽堿濃度范圍內，SOD活性隨著鹽堿濃度的增大而增大。

在融凍階段，對照組和鹽堿組紫花苜蓿幼苗體內的SOD活性均隨溫度降低呈上升趨勢。對照組變化不顯著，-3 ℃時比10 ℃時增加了4.51%。堿性鹽處理組中，10～0 ℃時SOD活性緩慢增強，0～-3 ℃時SOD活性明顯增強，-3 ℃與0 ℃時相比有顯著性差異（P<0.05），其余各溫度之間沒有顯著性差異?？梢?，溫度回升，幼苗解凍，植株受到的低溫脅迫減緩，SOD活性降低后趨于穩定。葉亞新等對低溫脅迫下小麥、玉米、蘿卜幼苗超氧化物歧化酶活性影響的研究表明，隨著脅迫溫度的降低，SOD活性呈先上升后下降的趨勢[18]。龔束芳等研究表明，在低溫脅迫下，偃麥草和高羊茅的SOD活性呈緩慢上升趨勢[19]。

2.5 POD活性的變化

由圖5可知，堿性鹽處理組的POD活性均高于對照組，增加了0.48%～6.35%。與其他指標相比，POD活性在堿性鹽脅迫下的變化不是特別明顯，但依然呈增加趨勢?？梢?，紫花苜蓿有一定的抗鹽堿能力，在堿性鹽脅迫下，紫花苜蓿幼苗通過增強POD活性抵抗逆性環境。孫偉澤對紫花苜?？果}脅迫的研究也證實了該結論，鹽堿脅迫對植物體內的POD活性具有促進作用[20]。

在凍融階段，對照組與鹽堿組POD活性均呈上升趨勢，在-3 ℃時較敏感，達到峰值7.89、8.33 U/g，與10 ℃時相比具有顯著性差異（P

3 結論與討論

3.1 凍融及堿性鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗中生物膜系統的影響

植物器官在逆境條件下常發生膜脂過氧化作用，MDA是其產物之一，可與蛋白質、核酸發生反應修飾其特征，抑制蛋白質的合成。通常將MDA作為膜脂過氧化指標，其含量多少反映了膜的穩定性與植物受傷害程度[21]。在凍融及堿性鹽雙重脅迫下，植物所受的最大傷害是膜質過氧化。在雙重脅迫環境中，細胞膜脂過氧化作用會造成MDA累積[22]。本試驗結果表明，紫花苜蓿幼苗的MDA含量在堿性鹽單因子脅迫、凍融及堿性鹽雙因子脅迫下均表現出增加的趨勢，幼苗生長受到脅迫，在逆境中產生了大量活性氧，致使細胞膜受損、MDA含量增加。在本試驗中-3～0 ℃低溫條件下，雙重脅迫下鹽堿組與對照組MDA含量的變化最為明顯?？赡艿脑驗榻鈨鲞^程中低溫持續時間較長，苜蓿幼苗細胞膜受到的傷害更為嚴重，這與已有研究的結果[23]一致。在逆境條件脅迫下，植物幼苗MDA含量隨著脅迫程度的加強而逐漸增大，MDA含量反映了凍融及鹽堿脅迫對植物的傷害程度。

3.2 凍融及堿性鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗體內滲透調節物質的影響

游離脯氨酸是植物體內重要的滲透調節物質，植物體通過調節滲透調節物質來維持體內滲透勢平衡。在正常條件下，植物體內游離脯氨酸的含量很低，但遇到干旱、低溫逆境脅迫時，體內脯氨酸大量累積，且累計指數與植物的抗逆性有關，因此可作為植物抗逆性的一項生化指標[24]。本研究結果表明，紫花苜蓿幼苗在逆性環境中通過調節脯氨酸含量來維持體內滲透平衡。雙重脅迫時的脯氨酸含量遠遠高于單因子脅迫，表明凍融條件下進行鹽堿處理對幼苗的危害更大，這是由于雙重脅迫下苜蓿既要通過脯氨酸進行滲透調節，又要抵抗低溫傷害，而后者是耗能過程，導致苜蓿生長受抑制。

蛋白質是植物細胞中最豐富的生物大分子，是生物體結構和功能最重要的基礎物質之一，作為酶的主要成分可參與細胞的化學反應[24]。本試驗研究發現，凍融及堿性鹽雙重脅迫下的蛋白質含量低于堿性鹽單因子脅迫，這可能是因為堿性鹽脅迫下幼苗生長受到抑制，蛋白質合成受阻，或蛋白質合成酶在雙重脅迫下被分解，還可能是因為蛋白質合成速率小于分解速率。試驗結果中蛋白質的變化規律與其他指標不盡相同，凍融循環過程中蛋白質含量隨溫度的降低而減少，這可能是因為低溫造成植物生長緩慢，受到低溫脅迫；持續進行低溫脅迫，植物產生抗逆性反應，蛋白質含量隨之升高；在 -3 ℃ 時，由于溫度過低造成了凍性傷害，蛋白質含量下降；隨著溫度回升，苜蓿幼苗解凍，脅迫壓力減緩，在抗逆能力的促使下蛋白質含量增加并趨于穩定。王會良等研究植物的抗寒性機理時總結了前人的研究結果，發現多數研究認為低溫脅迫會引起蛋白質增加[25]，本試驗結果與之一致。

3.3 凍融及堿性鹽脅迫對紫花苜蓿幼苗體內保護酶系統的影響

植物處于鹽堿、低溫等逆境脅迫時，細胞內的活性氧會大量積累，超出正常水平，對細胞造成過氧化傷害。此時植物通過提高抗氧化酶系統的活性來清除活性氧，保護自身免受活性氧的傷害[26-27]。

SOD是保護植物細胞免受活性氧傷害的第一道防線，普遍存在于植物體內，具有將超氧陰離子自由基轉化為H2O2的功能，保護植物免受羥自由基的傷害，其活性大小可直接反映植物受活性氧脅迫和耐受活性氧脅迫的能力[28-29]。本試驗結果表明，凍融及堿性鹽雙重脅迫下苜蓿幼苗體內的SOD活性高于堿性鹽單因子脅迫。在凍融脅迫下，堿性鹽處理組的變化比對照組更為明顯，表明雙重脅迫下幼苗受到的傷害更為嚴重。溫度降至-3 ℃時，對照組與鹽堿組的差距更為顯著，隨著溫度的回升差距雖有減小但依然明顯，表明凍融過程中的持續低溫對幼苗造成損傷，導致活性氧含量過高，此時植物體誘導SOD活性增強以減少活性氧的傷害。這與李銳等關于棉花幼苗耐低溫能力的研究結果[30]一致，低溫可誘導植物體內SOD活性增強。

POD能夠迅速消除植物體內H2O2造成的傷害，被認為是植物體內保護細胞免受H2O2傷害的主要酶。本試驗結果表明，凍融及堿性鹽雙重脅迫下苜蓿幼苗體內的POD活性增強，在凍融周期內呈先升高、后下降、最后趨于穩定的規律。-3 ℃時幼苗體內POD活性最大，表現最為敏感，這可能是由于此時幼苗受到的脅迫最為嚴重，體內產生較多H2O2，促使幼苗產生抗逆反應，誘導防御系統中的POD活性增強。

4 結論

凍融及堿性鹽脅迫下，苜蓿幼苗體內MDA含量增加，幼苗體內膜脂過氧化傷害加劇，活性氧大量增加，細胞膜系統受損，苜蓿幼苗通過誘導SOD、POD活性的增強，快速消除活性氧，防御超氧陰離子自由基對植物體的傷害。在本試驗條件下，苜蓿幼苗仍能繼續生長，表明苜蓿幼苗具有一定的抗鹽堿和抗寒能力，為寒冷地區鹽堿地的利用提供了依據。苜蓿作為優良牧草，對土壤鹽漬化環境的適應能力較強，同時具有抗寒能力，在寒冷地區鹽堿地的利用中具有良好發展前景。

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