環境激素睪丸酮、孕酮對萼花臂尾輪蟲繁殖的影響

周西　季亞培　黃文婷

摘要：研究了在種群試驗條件下，睪丸酮和孕酮對萼花臂尾輪蟲生殖參數（受精率、混交雌體比率、休眠卵/雌體百分率）的影響。結果顯示，睪丸酮的48 h-EC50、NOEC、LOEC分別為511.0、0.1、1.0 μg/L。睪丸酮為10 μg/L時，可顯著誘導萼花臂尾輪蟲混交雌體和休眠卵的產生；100、1 000 μg/L時，添加睪丸酮能使萼花臂尾輪蟲的休眠卵孵化率分別顯著提高83.67%、85.71%；100 μg/L時，可使輪蟲交配率提高87.5%。孕酮的48 h-EC50為4.3 mg/L，2.0 mg/L 的孕酮可使萼花臂尾輪蟲的種群增長率提高20.89%；2.5 mg/L時最適宜促進混交雌體和休眠卵的產生；2.5、3.0 mg/L時可使萼花臂尾輪蟲的孵化率分別提高51.98%、1.47倍；3.0、3.5 mg/L時可顯著提高輪蟲受精率。

關鍵詞：萼花臂尾輪蟲；睪丸酮；孕酮；混交雌體；生殖參數

中圖分類號： X171.5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0286-04

萼花臂尾輪蟲（Brachionus calyciflorus）具有分布廣、繁殖快、易培養等特點，是淡水生態系統的重要組成部分，其休眠卵可通過商業渠道獲得。20世紀70年代，輪蟲被推薦作為生態毒理受試動物[1]；20世紀90年代，萼花臂尾輪蟲、褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）分別被美國試驗材料協會（American Society for Testing and Materials，ASTM）采納，正式成為淡水、海水生態毒理研究的標準受試動物[2]。甲基睪丸酮、孕酮是由脊椎動物分泌的類固醇激素，進入水體中會對生物內分泌產生干擾。輪蟲受精和休眠卵產量等受內分泌機制的調控，因此其生殖指標可作為測定環境激素對水生無脊椎動物內分泌干擾的有效方法。已有研究證實，輪蟲的生長生殖可受一些環境激素的影響[3-4]。一定濃度孕酮可增加臂尾輪蟲（Brachionus manjavacas）產休眠卵的數量并明顯降低其內稟增長率[5]。氰戊菊酯（fenvalerate）、三丁基氯化錫（TBTC）對萼花臂尾輪蟲生命周期中各發育階段歷時和種群增長均有顯著影響[6]。然而，已有研究多建立在環境效應藥物上，即具有雌性或雄性效應的藥物，而關于外源性哺乳動物分泌的性激素對萼花臂尾輪蟲生長生殖的影響鮮有報道。研究在睪丸酮、孕酮等典型類固醇激素作用下萼花臂尾輪蟲生殖情況的變化，并分析各種參數，尋找性激素對輪蟲生殖干擾的參考指標，以期為輪蟲繁殖生物學與生態毒理學的結合提供新的研究思路。尋求適當的激素刺激，以促進輪蟲由無性生殖向有性生殖轉化，從而提高其休眠卵產量，在生產中具有實踐意義。

1 材料與方法

1.1 輪蟲的預培養

試驗采用萼花臂尾輪蟲（Florida，USA，1983品系）的冷凍休眠卵，于24孔塑料培養板中孵化，每孔加入0.8 mL EPA培養基[7]（蛋白核小球藻的濃度控制在3.0×106～3.5×106 個/mL），進行單克隆培養。挑取齡期小于4 h且活潑健壯的新生幼體進行試驗。輪蟲的培養條件為光照度約4 000 lx、光—暗周期16 h—8 h、溫度（25±1） ℃。

1.2 試驗藥品的配制

采用丙酮溶液作為溶劑，分別將甲基睪丸酮、孕酮配制為10 000 mg/L的母液。將EPA培養基和濃縮離心后的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）（HB4培養基）配制為不同濃度梯度的試驗溶液，小球藻濃度控制在約4×106 cells/mL，小球藻培養條件與楊家新等的培養條件[8]相同。

1.3 相關試驗參數和計算方法

種群增長率：r=（lnNt-lnN0）/T（Nt為種群在t d時的種群數量，N0為起始數量，T為試驗時間）?；旖淮企w與非混交雌體比：MF/AF=混交雌體數/非混交雌體數。攜卵與非攜卵比：OF/NOF=攜卵/非攜卵（ovigerous female/non-ovigerous）?；旖话俜致剩篗F=MF/（MF+MPF+AF）×100%（MF為混交雌體，AF為非混交雌體，MPF為產雄雌體）。受精百分率：受精百分率=產休眠卵/總混交雌體。受精率：受精率=攜休眠卵雌體數/總雌體數。交配率：交配率=雄體相遇次數/（雄體相遇次數+成功交配次數）[9]。

1.4 種群動態學試驗

取齡期小于4 h的輪蟲幼體置于試管（直徑1 cm、長度10 cm）中，4個/管，加入8 mL不同質量濃度的試驗溶液（甲基睪丸酮質量濃度分別為0.1、1、10、100、1 000 μg/L，孕酮質量濃度分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L），每組設置5個平行組，另設1個空白組。每隔24 h振蕩試管，使藻液分散均勻。于48 h時計數，并計算種群增長率和EC50值。于 96 h 時分別對非混交雌體、攜雄卵雌體、攜休眠卵雌體、非攜卵雌體、休眠卵進行計數，類別鑒定方法與Paloheimo的方法[10]相同。7 d后對各質量濃度組試管底部的休眠卵進行計數并收集，風干后放入1 mL EPA Eppendorf離心管中，置于 4 ℃ 冰箱。30 d后取出該休眠卵置于6孔塑料培養板中孵化，置入30個/孔，加入5 mL EPA培養基，每組設置5個平行組，連續觀察并計算孵化率。試驗過程中不更換培養溶液。

1.5 受精率試驗

對輪蟲進行單克隆培養，從中挑取出8～9個2～4 h齡的非混交雌體以及剛產出的雄體，分別按照雌雄性比1 ∶ 2放入05 mL不同質量濃度的試驗溶液中，于24孔板中培養。睪丸酮的質量濃度分別為1、5、25、125、625 μg/L，孕酮的質量濃度分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L。每組設3個平行組，另設1個空白對照組。試驗開始24 h后移去雄體，之后每隔8 h移去攜非混交卵的雌體、產雄卵的混交雌體，保留產休眠卵的雌體，并于試驗進行72 h后統計攜休眠卵的雌體數和總雌體數。試驗過程中每隔12 h更換1次培養溶液。

1.6 受精行為觀察

隨機挑取齡期小于4 h的非混交雌體和剛產出的雄體，分別放入不同質量濃度的藥物（睪丸酮、孕酮質量濃度同“15”節）中，不添加任何藻液。每組設5個平行組及1個對照組，置于96孔板中培養，反應體系控制在100 μL以內。在室溫（23～25 ℃）下通過解剖鏡連續觀察20 min，根據Snell等的試驗方法[5]記錄雌體和雄體相遇次數及成功交配次數。

2 結果與分析

2.1 睪丸酮、孕酮對萼花臂尾輪蟲2 d種群增長率的影響

由圖1可知，睪丸酮、孕酮均對萼花臂尾輪蟲的增長率具有顯著影響（LSD，F=24.877，df組間=5，df組內=24，P

與對照組相比，3～4 mg/L孕酮組的種群增長率降低，4 mg/L 孕酮組的種群增長率下降了38.40%，差異顯著（Dunnett檢驗，P<0.01）。Prohit分析得到孕酮的

EC50為4.3 mg/L。

2.2 睪丸酮、孕酮對萼花臂尾輪蟲4 d種群動態學的影響

統計結果（表1、表2）表明，睪丸酮對萼花臂尾輪蟲的MF/AF、混交率、7 d休眠卵產量、休眠卵/雌體比均具有極顯著影響（LSD，F值分別為4.285、4.379、4.493、4.165，df組間均為5，df組內均為24，P均小于0.01），對受精率也具有顯著影響（LSD，F=2.749，df組間=5，df組內=24，P005），孕酮對受精率的影響也不顯著（F=0.177，df組間=5，df組內=24，P>0.05）。

2.3 睪丸酮和孕酮對萼花臂尾輪蟲休眠卵孵化率的影響

由圖2可知，睪丸酮和孕酮對萼花臂尾輪蟲休眠卵的孵化率均具有極顯著影響（F分別為7.28、31.28，df組間=5，df組內=24，P<0.05），呈先升高后降低的趨勢。

2.4 睪丸酮、孕酮對萼花臂尾輪蟲受精作用的影響

試驗結果（圖3）表明，睪丸酮對萼花臂尾輪蟲混交雌體的受精率沒有顯著影響（LSD，F=2.21，df組間=5，df組內=138，P>0.05），而孕酮對輪蟲受精率的影響極顯著（LSD，F=379，df組間=5，df組內=90，P<0.01），大致呈拋物線形。

2.5 睪丸酮對萼花臂尾輪蟲雄體交配行為的影響

由圖4可知，在睪丸酮的影響下，雄體的交配行為差異極顯著（LSD，F=6.93，df=24，P<0.05）。隨著質量濃度的增加交配率明顯降低，表明雄性激素可提高雄體交配率。

3 結論與討論

3.1 睪丸酮、孕酮對萼花臂尾輪蟲種群增長的影響

目前，關于外源雄性激素對萼花臂尾輪蟲生殖影響的報道較少，多數集中于環境雌激素對輪蟲生殖生理的影響。Radix 等研究發現，萼花臂尾輪蟲的睪丸酮72 h-EC50為 26.3 μmol/L[11]，而本試驗中得出的睪丸酮48 h-EC50約為511 μg/L，可能是由于不同品系的萼花臂尾輪蟲存在一定差異。本試驗中睪丸酮質量濃度為1～1 000 μg/L時，內稟增長率r大幅下降，與Radix等發現的r值在0.58 μmol/L睪丸酮刺激下發生下降[11]相似。Snell等研究表明，孕酮質量濃度低于10 mg/L時對臂尾輪蟲Brachionus manjavacas種群增長無顯著影響，高于14 mg/L時可對其產生抑制，而12 mg/L孕酮對海水種褶皺臂尾輪蟲（B. plicatilis）無顯著影響，表明高濃度環境激素對輪蟲產生一定毒性效應[5]。本試驗得到了相似結果，在2.0～2.5 mg/L時r值下降，可能是由于投喂食物的濃度和種類不同，對輪蟲種群數量具有不同程度的影響。

3.2 睪丸酮和孕酮對萼花臂尾輪蟲混交雌體的促進作用

本試驗中，睪丸酮在EC50值附近對MF/AF和MF%值均具有顯著影響，在0.1～100 μg/L范圍內混交雌體比率上升，以r值為指標得出的EC50值與群體條件下得出的MF%、MF/AF 值具有一定的計量-效應關系，呈拋物線形；但對于 OF/NOF 值沒有顯著影響?？梢?，r值并不是判斷睪丸酮對萼花臂尾輪蟲生殖影響的理想指標，但該值仍是敏感的檢測指標[12-14]。孕酮對混交雌體也有類似的促進作用，表明類固醇激素對輪蟲內分泌產生干擾，刺激無性生殖向有性生殖轉變，從而促發大量混交雌體的產生。

3.3 類固醇激素對萼花臂尾輪蟲休眠卵生成和孵化的影響

Gallardo等在萼花臂尾輪蟲的群體培養中發現，0.05、050 mg/L保幼激素（JH）刺激可將混交雌體發生率提高30%[15]。本研究表明，10、100 μg/L睪丸酮和2.0、2.5 mg/L孕酮可促進萼花臂尾輪蟲休眠卵的產生?？赡苁怯捎谠陬惞檀技に氐淖饔孟禄旖淮企w大量出現，產雄雌體相對增加，藥物對雄體、產雄雌體內分泌產生干擾，使雄體活力增強、受精率提高，進而影響卵雌比。

Snell發現孕酮對B. manjavacas休眠卵的孵化率具有明顯影響，而對萼花臂尾輪蟲無影響，本試驗結果與之不一致，可能是由于休眠卵萌發也受到母體攝食類型的影響。在萼花臂尾輪蟲對淡水水體中內分泌干擾物和重金屬的研究中發現，輪蟲在有性生殖階段對環境刺激的反應比無性生殖階段更敏感[16]。本研究結果顯示，對于環境激素中的雌性激素（孕酮）和外源性的雄性激素（睪丸酮），休眠卵的孵化率是評價水體中內分泌干擾物的良好指標；加入此類性激素可在不破壞生態環境的基礎上對萼花臂尾輪蟲休眠卵的產生、孵化率的提升具有促進作用，在實際生產中具有一定利用價值。

3.4 環境激素對萼花臂尾輪蟲有性生殖階段中受精率和受精行為的影響

目前對輪蟲交配行為的研究主要集中于萼花臂尾輪蟲屬[17-18]，而對于不同環境激素作用下輪蟲受精作用的研究較少。本試驗結果表明，在雌雄性比相同時，睪丸酮對輪蟲混交雌體的受精率無顯著影響，而一定質量濃度范圍內的孕酮可顯著提高受精率，促進輪蟲交配行為的發生。Snell等研究發現，橈足類個體交配行為的發生依賴于水體中物種特異性接觸的信息素類物質[19]，輪蟲交配行為的發生與其類似。雄體通過頭冠上的受體來獲取雌體表面糖蛋白的化學信息，交配行為受到信號質量和強度的影響。本研究發現，睪丸酮在100 μg/L時顯著提高輪蟲的交配率，因此認為水體中性激素的存在干擾了自然的信息素，使雄體表現出不同程度的交配行為。雄體交配率的高低與最終混交雌體產生休眠卵的高低之間沒有數量級關系，表明休眠卵的產生與交配次數無關，而可能與性激素對雌體內分泌系統的干擾有關。關于這種信息素類物質的結構、是否真實存在或被提取并無定論[20-22]，性激素的存在是否真正影響到此類物質，或直接對雄體的生理生化反應產生影響，有待借助分子生物學手段進一步研究。

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