地塞米松促進豬繁殖與呼吸綜合征病毒致病性

王永娟　朱善元　劉博

摘要：為檢測地塞米松對豬感染PRRSV后免疫力及致病性的影響，將6頭健康豬平分為2組，分別注射地塞米松和生理鹽水，連續注射3 d。檢測注射前、注射后1周的PRRSV抗體陽性率及病毒量，觀察并記錄體溫、呼吸、飲食、眼結膜、糞便等臨床情況。結果顯示，豬的PRRSV抗體陽性率為100%，但注射后的抗體值高于注射前；病毒蛋白半定量結果顯示病毒感染量顯著增加；注射地塞米松組的豬表現出一定臨床癥狀，而對照組未發生變化。結果表明，地塞米松會增加PRRSV的發病風險，為建立防治PRRSV感染的動物模型奠定了基礎，為獸醫臨床中合理使用糖皮質激素類藥物提出新的要求。

關鍵詞：糖皮質類激素；地塞米松；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；致病性

中圖分類號： S858.28 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0293-02

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）廣泛存在于各養殖場，可引發免疫逃避，呈帶毒但不發病、條件性致病狀態[1]。發病時表現為PRRSV與其他病原同時存在，呈繼發或并發感染[2]。病豬的臨床癥狀變化較大，通常出現體溫升高、食欲下降、氣喘咳嗽、肢體末端瘀血、共濟失調、運動減少、精神狀態不佳等癥狀，死亡率達50%以上，母豬流產率達30%以上，給養豬業造成了巨大損失[3-4]。PRRSV抗體產生較早，但初始1周內產生的抗體不具有中和作用，僅能作為一種指示性抗體用于病毒感染的早期檢測；中和抗體產生比較緩慢，一般于病毒感染后1～2個月出現[5]。

地塞米松為代表性糖皮質激素類藥物，對抗炎、免疫抑制、抗內毒素、抗休克、影響代謝具有顯著作用[6-10]，在獸醫臨床中被廣泛應用于治療母畜代謝病，或與抗生素聯合用于治療感染性疾病。有報道表明，地塞米松等糖皮質激素可上調PRRSV受體的表達[11]，促進PRRSV感染或致病。擬將地塞米松注射于健康豬，通過臨床癥狀、標志性抗體、病毒量等方面摸索開展PRRSV試驗感染的條件，為建立防治PRRSV感染的動物模型奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

豬繁殖與呼吸綜合征ELISA抗體檢測試劑盒購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所。地塞米松（國藥準字H41020036）由江蘇農牧科技職業學院動物實習醫院提供。RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、Taq DNA聚合酶、1 kb DNA Ladder、瓊脂糖、病毒RNA提取試劑盒均購自美國Promega公司。

1.2 試驗動物

30日齡健康仔豬購自江蘇省如皋市某規?；B殖豬場。

1.3 豬群PRRSV抗體檢測

在如皋市某豬場選取10頭未發病的30日齡仔豬，無菌采血并分離血清，按照豬繁殖與呼吸綜合征ELISA抗體檢測試劑盒使用說明書檢測抗體水平，分別讀取D450 nm，每個血清樣品做2個重復。按照該試劑盒的判斷標準，被檢血清平均吸光值（S）/標準陰性血清平均吸光值（N）值≥2.40判為陽性，<2.40判為陰性。

1.4 適應性飼養與藥物注射

根據S/N值判斷仔豬的PRRSV抗體陽性率，選擇其中讀值較低的6頭豬，分別稱其質量，用耳號鉗標記，適應性飼養于經氯仿消毒的畜舍。3 d后，將1～3號豬作為地塞米松注射組，按0.067 mg/kg的劑量進行肌肉注射，每天09：00、15：00各1次，連續注射3 d；將4～6號豬作為生理鹽水注射組（陰性對照）。

1.5 臨床癥狀觀察

自注射地塞米松1 d起每天觀察并記錄食欲、精神狀態、皮膚、呼吸、眼結膜、體溫、糞便等臨床癥狀，連續觀察7 d。

1.6 試驗豬PRRSV抗體檢測

于停止注射1周后無菌采集豬血并分離血清，按照“1.3”節的抗體檢測方法分別測定6頭豬的D450 nm。

1.7 病毒半定量測定

根據GenBank已公布的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）、低致病性PRRSV（LP-PRRSV）的Nsp2基因序列，分別設計能擴增出400 bp或（和）264 bp的特異性上、下游引物，同時設計能擴增出600 bp β-actin的上、下游引物[12]。于注射1周后采集6頭豬的唾液，按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取其總RNA，進行Nsp2基因的半定量RT-PCR檢測，電泳后采用ND-1000型分光光度計進行灰度掃描，根據各組Nsp2基因變化判斷病毒量。

2 結果與分析

2.1 豬群PRRSV抗體

按照PRRSV抗體檢測試劑盒說明書，測得10頭未發病30日齡仔豬的PRRSV抗體D450 nm值（表1），根據該試劑盒的判斷標準，判斷10頭被檢豬的陽性率為100%，但是均未發病。

2.2 臨床發病記錄

按照D450 nm值由低到高的順序選擇6頭被檢豬進行分組試驗，自注射地塞米松1 d起觀察每頭豬的臨床癥狀。結果顯示，生理鹽水注射組（對照組）未出現明顯臨床癥狀，地塞米松注射組（試驗組）的豬出現食欲下降、精神萎靡、皮膚瘀血、眼結膜潮紅、腹瀉癥狀。體溫記錄見圖1，呼吸數記錄（n=3）見圖2，試驗組的體溫與呼吸數于注射地塞米松3 d起開始升高。

2.3 試驗豬PRRSV抗體

于停止注射1周后測定豬的PRRSV抗體水平，D450 nm吸光值見表2。根據該試劑盒的判斷標準，判斷試驗豬的陽性率與注射前一致，均為100%，但注射組血清的吸光值明顯高于對照組血清。

2.4 病毒基因半定量測定

唾液樣品中病毒基因Nsp2的RT-PCR半定量檢測結果見圖3。6頭豬均為LP-PRRSV病毒感染，而無HP-PRRSV病毒感染，試驗組豬的病毒基因表達量比對照組提高3倍左右。

3 結論與討論

PRRSV病毒嗜好在肺泡巨噬細胞（PAM）、肺血管內巨噬細胞（PM）內復制[13]，可在數小時至數天內破壞大量巨噬細胞，造成肺、淋巴結的損傷，使其對異物的非特異性吞噬清除功能大幅降低，易繼發其他細菌或病毒感染[2]。已有研究表明，其他病原的協同感染往往可刺激PRRSV受體表達，從而使豬更易感染，這是PRRSV常與其他疾病同時存在的根本原因。自然狀態下的PRRSV復制不易成功，為在實驗室開展PRRS的攻毒保護試驗，有必要摸索PRRSV的感染條件。地塞米松等糖皮質激素可上調PRRSV受體的表達[11]，理論上可模擬其他病原促進PRRSV感染或致病。本研究選取感染PRRSV但未發病的豬為試驗動物，人為注射地塞米松，結果顯示地塞米松注射組的豬可在短時間內出現典型的PRRS癥狀，且抗體水平及病毒量均明顯上升，而對照組未出現異常癥狀。結果表明，地塞米松可作為誘導劑增加豬感染PRRSV的風險并引起發病，可為今后建立PRRSV相關研究的試驗動物模型奠定基礎。

動物模型的建立一般應選擇SPF動物，在隔離條件下進行試驗。鑒于PRRSV帶毒豬多、PRRSV抗體陰性豬場較少、SPF豬價格昂貴且運輸不便等試驗條件的限制，本試驗選取帶毒未發病仔豬，確保其他條件完全一致的情況下設立試驗組與對照組，從臨床癥狀、標志性抗體、病毒量方面判斷地塞米松對PRRSV感染的影響，結果與預期一致，表明此方案具有可行性。

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