二硫蘇糖醇還原—高效液相色譜法測定蔬菜中的還原型維生素C和總維生素C含量

鄭小曼　顧明華　沈方科

摘要：研究建立高效液相色譜法（HPLC）快速檢測蔬菜中還原型維生素C含量的方法，并通過二流蘇糖醇（DDT）還原脫氫型維生素C，從而得到總維生素C、脫氫型維生素C含量。以3%偏磷酸為提取液，乙腈-0.015 mol/L磷酸二氫銨溶液（體積比85 ∶ 15）為流動相，流速為1.5 mL/min，采用Waters C-18（150 mm×3.9 mm，5 μm）反相色譜分離，用紫外檢測器于254 nm波長下檢測。結果表明：在1～500 mg/L濃度范圍內線性良好（r=0.999 6），所有蔬菜樣品檢測相對標準偏差為0.63%～1.83%，平均加標回收率為99.89%。用該方法測定蔬菜中維生素C含量，結果穩定、重現性良好，適用于維生素C含量范圍較大及顏色各異的多種蔬菜。

關鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）；二流蘇糖醇（DDT）；蔬菜；總維生素C；還原型維生素C

中圖分類號： S132；O652.63 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0304-03

維生素C是一種人類必需的營養素[1]，其主要形式為L-還原型、L-脫氫型，最主要的功能是參與膠原蛋白質的合成，動物缺乏維生素C會造成壞血病[2]。作為一種抗氧化劑和高活性物質，維生素C參與許多新陳代謝過程，可以保護人體免于自由基的威脅，具有提高免疫力，預防癌癥、心臟病、中風，保護牙齒和牙齦，抗衰老等許多生理作用[2-4]。有研究表明：一定劑量的維生素C可抗細胞DNA損傷[5]；在老鼠鉛中毒的同時及其后，補充維生素C可降低血鉛濃度[6]；此外，維生素C還具有預防乙醇對腦、肝損傷的作用[7]。人類自身不能夠制造維生素C，其廣泛的食物來源為各類新鮮果蔬，并且蔬菜中的總維生素C含量相比還原型維生素C更能夠表征蔬菜的營養價值。因此，建立能夠快速檢測蔬菜中總維生素C含量的方法十分重要，能為人們的膳食營養提供更為確切的參考，從而有效預防和抵制因體內缺少維生素C而帶來的不利影響，提高人們的工作效率和生活質量。

維生素C的測定方法有多種，各有優缺點。如《中華人民共和國藥典》規定的碘量法因其試驗操作時不易把握酸度、碘易揮發等，使得測定結果準確度降低，不適于微量分析；而大多數水果、蔬菜的提取液具有一定色澤，又使得以顏色變化來辨別其滴定終點的國標法2，6-二氯靛酚滴定法（GB/T 6195—1986《水果、蔬菜維生素C含量測定法（2，6-二氯靛酚滴定法）》）具有一定的局限性；此外，還包括容量法、苯肼比色法、熒光光度法、電位法、紫外分光光度法等，但是這些方法或存在所需試劑較多、試劑不穩定、操作繁瑣等缺點[8-10]，或只能測定還原型維生素C含量，不能測定具有同樣生理功能的脫氫型維生素C含量，如熒光法、苯肼比色法[11]。

高效液相色譜（HPLC）是近年來發展起來的一種快速高效且穩定可靠、發展較快的分離技術，因其處理樣品簡單快速，且能同時測定幾種維生素而被廣泛應用于食品藥品中維生素含量的測定[8-17]。但是，該方法目前主要測定的是還原型維生素C[11]，而對蔬菜中同樣具有生理功能的脫氫型維生素C含量的檢測報道較少。本研究通過利用二硫蘇糖醇（DTT）能夠將脫氫型維生素C還原而不具有生理活性的二酮古洛糖酸則不會被還原[17-18]，并且與高效液相色譜法結合，可測定出還原型維生素C、總維生素C含量，從而得出脫氫型維生素C含量，以總維生素C含量表征蔬菜的營養價值更為準確。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈，色譜純；磷酸二氫銨，分析純；維生素C標準品，分析純，維生素C含量≥99.7%，國藥集團化學試劑有限公司；偏磷酸，分析純；二硫蘇糖醇（DTT）；超純水，筆者所在實驗室自制；0.45 μm濾膜，國藥集團化學試劑有限公司。小白菜、番茄，市購。

1.2 儀器與設備

Waters e2695型高效液相色譜，美國；Waters DELTA-PAK C18色譜柱，日本；Waters 2998 PAD紫外檢測器；DP-01隔膜真空泵，天津市東康科技有限公司；KQ2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MILLI-Q型超純水裝置。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 Waters DELTA-PAK C18色譜柱，柱長150 mm，內徑3.9 mm，顆粒大小5 μm；檢測波長為254 nm。根據本試驗高效液相色譜儀的性能特點，選擇乙腈 -0.015 mol/L NH4H2PO4（體積比85 ∶ 15）作為流動相；流速為1.5 mL/min，進樣量10 μL，柱溫25 ℃；以保留時間定性，待液相色譜穩定后進樣分析，以峰面積定量。

1.3.2 樣品制備 稱取新鮮小白菜、番茄樣品各4.00 g，迅速剪碎后加入少量3%偏磷酸研磨制成勻漿，用3%偏磷酸定容至100 mL棕色容量瓶中，過濾，再吸取一部分濾液過 0.45 μm 微孔濾膜，然后按“1.3.1”節色譜條件進行HPLC測定，所得數值為還原型維生素C含量。脫氫型維生素C含量=維生素C總量-還原型維生素C含量，前提是將樣品中脫氫型維生素C還原為還原型維生素C。因此，另吸取 0.5 mL 濾液，加入1.00 mL 1%二硫蘇糖醇溶液（DTT），反應還原 0.5 h 后，過0.45 μm 濾膜進樣，同樣按“1.3.1”節色譜條件進行測定，所測數值為樣品溶液中的總維生素C量。

1.3.3 線性關系分析 準確稱取50 mg維生素C，用1.5%偏磷酸溶液定容至100 mL棕色容量瓶中，得到500 mg/L維生素C標準儲備液；將其逐級稀釋得到50、10 mg/L標準溶液，過0.45 μm濾膜，調整進樣量，稀釋得到1、5、10、20、30、50、100、200、300、400、500 mg/L系列濃度對應的峰面積，以峰面積的積分值對進樣濃度（mg/L）進行直線回歸。

1.3.4 精密度試驗 取所制得樣品4個，重復進樣5次，測定維生素C含量的精密度。

1.3.5 回收率試驗 采用加標回收法，取2.00 mL勻漿樣品，分別加入2.00 mL濃度為50、100、500 mg/L的維生素C標準品，重復進樣3次，取3次測定的平均值作為測定結果。將測定結果扣除樣品溶液的測定值，從而得到加入標準物質的回收率，其計算公式為：

回收率=（加標試樣測定值-試樣測定值）/加標量×100%。

1.3.6 最低檢測限的計算 以產生3倍儀器噪聲水平的進樣量為檢出限。

2 結果與分析

2.1 維生素C提取劑的選擇

考察不同提取劑（3%草酸、3%偏磷酸）對維生素C峰型的影響，結果表明：當選擇3%草酸作為本研究蔬菜樣品提取劑時，出現維生素C峰尖圓滑不尖銳、基線不平等現象；而以3%偏磷酸作為提取劑能夠得到更好的峰形（圖1），因此選擇3%偏磷酸作為蔬菜樣品提取劑。

2.2 流動相的選擇

考察乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4不同比例（體積比 50 ∶ 50、75 ∶ 25、85 ∶ 15）對檢測時維生素C的峰形、保留時間等出峰情況的影響。結果表明：當選擇乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4（體積比85 ∶ 15）作為流動相時，不僅出峰時間提前，峰形也更好，也不存在峰形重疊等問題，因此選擇乙腈-0.015 mol/L NH4H2PO4（體積比85 ∶ 15）作為流動相。

2.3 色譜條件的選擇

用Waters 2998 PAD紫外檢測器檢測發現，維生素C在245～255 nm波長下吸光度較高，在254 nm吸光度最大，因此選擇254 nm作為檢測波長。在超過樣品的檢測時間（4 min）后的6 min內，沒有發現有明顯的信號強度，因此確定樣品檢測時間為4 min。由圖2可以看出，所有樣品均能實現基線分離，而且峰形能滿足測定要求，維生素C的保留時間為0.866～0.929 min，檢測限為0.86 μg/L。

2.4 標準工作曲線

以1、5、10、20、30、50、100、200、300、400、500 mg/L系列濃度對應峰面積的積分值對進樣濃度（mg/L）進行直線回歸。以濃度（x，mg/L）為自變量、峰面積（y）為因變量，方程式：y=167 33x-262 03，r=0.999 6，說明標準曲線在1～500 mg/L范圍內線性良好，維生素C標準品的色譜結果見圖2，標準曲線見圖3。

2.5 蔬菜中維生素C含量的測定

由圖4、圖5可以看出，經過DTT的還原，總維生素C的峰高高于還原型維生素C。由表1小白菜、番茄中還原型維生素C、總維生素C、氧化型維生素C的檢測結果可見，各提取液中維生素C的保留時間在0.898～ 0.995 min。

2.6 精密度試驗

對同一小白菜、番茄提取液分別連續進樣5次，由表2可見，精密度試驗標準差為0.49～3.29，變異系數為0.63%～1.83%，表明該方法重現性較好。

2.7 回收率試驗

各取3份2 mL維生素C含量為25.106 mg/kg的小白菜提取液、維生素C含量為18.248 mg/kg的番茄提取液，分別加入2 mL不同濃度的維生素C標準液，測定混合液中維生素C含量，每種混合液測定3次，取其平均值。由表3可見，回收率范圍為96.58%～103.59%，平均回收率為99.89%。

3 討論與結論

維生素C在pH值>7.6以上的溶液中非常不穩定，但是在pH值<4的酸性溶液中較穩定，3%草酸、3%偏磷酸皆滿足pH值

磷酸與維生素C的這些特點，本研究采用3%偏磷酸提取番茄、小白菜中的維生素C后，其峰形更為尖銳、基線相對平穩，可見以3%偏磷酸作為提取劑能夠得到更好的峰形。但是，由于偏磷酸不穩定，需要現配現用才能保證提取效果。

利用高效液相色譜與二硫蘇糖醇還原維生素C相結合，對小白菜、番茄的還原型維生素C、總維生素C含量進行測定。結果表明，新鮮小白菜中含有還原型維生素C含量為 62.297 mg/100 g，總維生素C含量為273.390 mg/100 g；新鮮番茄中還原型維生素C含量為45.888 mg/100 g，總維生素C含量為197.406 mg/100 g?？偩S生素C、還原型維生素C二者之差為脫氫型維生素C，本研究中小白菜、番茄的脫氫型維生素C含量分別為211.092、151.518 mg/100 g?？梢钥闯?，在本研究的小白菜、番茄中，脫氫型維生素C含量在總維生素C含量中占很大的比重，而脫氫型維生素C與還原型維生素C同樣具有生理功能，對人體健康的貢獻不可忽視。本研究認為，只利用高效液相色譜法測定的還原型維生素C不足以說明蔬菜中維生素C的營養狀態，應利用二硫蘇糖醇的還原作用，得到的總維生素C含量更能表征蔬菜的營養價值。

本研究標準工作曲線的相關系數r=0.999 6，曲線在1～500 mg/L范圍內線性良好，說明曲線的線性關系較好，且測定濃度范圍較廣，分析中受樣品中其他雜質的影響較小。測定小白菜、番茄中維生素C的含量，回收率為96.58%～10359%，說明該方法具有所需試劑少、穩定、操作簡便等特點。從本研究還可以看出，精密度試驗的相對標準偏差小于2%，說明該方法重復性、再現性都是比較高的；而且從樣品色譜圖中看出，該方法分析維生素C的含量大約需要3 min，具有靈敏、快速的特點。本研究所用的這個分析方法是可靠的，它適用于維生素C含量范圍較大及顏色各異的廣泛蔬菜中還原型維生素C、總維生素C含量的測定。

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