嗜鹽單胞菌ST-1的分離及其石油烴類降解特性的研究

秦春艷

（中國航天建設集團有限公司 北京 100071）

嗜鹽單胞菌ST-1的分離及其石油烴類降解特性的研究

秦春艷

（中國航天建設集團有限公司 北京 100071）

從油田石油污染物中分離出了一株菌株ST-1，通過形態和16S rDNA序列的分析，初步鑒定屬于Halomonas的一個種。對該菌株降解石油烴的能力進行了實驗，結果表明，菌株生長的指數期石油烴降解速率較大， 最大降解率達到80%以上， 降解的最適溫度為27～34℃，最適 pH 為 6.8～8.3。提高接種量可以加快反應速度。

嗜鹽單胞菌 石油烴 降解特性

廣泛存在于土壤、地下水、海洋、湖泊等環境中的天然微生物種群對石油烴的降解作用是石油污染物從環境中消除的基本途徑之一［1,2］。

本文從大慶油田石油污染土壤中分離篩選到一株菌株ST-1,通過形態和16S rDNA序列分析對菌株進行了鑒定,并對其石油烴降解的特性進行了研究,以期為該菌株在石油污染物的降解中的應用提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 培養基

富集培養基（g/L）：KH2PO43.48,Na2HPO41.5,MgSO40. 70,（NH4）2SO44,酵母粉0.01,2%乙醇,0.5%柴油,PH=7.0～7.2。用于石油烴降解菌的富集培養。

配制牛肉膏蛋白胨培養基,用于菌株的形態觀察、保存及活化。

1.2 石油烴降解菌的分離和篩選

取無菌水（含有玻璃珠）90ml,將其中加入土樣10g或水樣10ml。取富集培養基95ml,將其中加入上清液5ml,于25℃,200r/min的搖床富集培養3d。取新鮮的富集培養液80ml,將其中轉接入培養液20ml,繼續培養,一共轉接4次。

取富集培養液,按梯度稀釋后,涂平板,在25℃條件下培養3d,隨機挑取菌落,采用劃線的方法反復分離純化,直至得到純培養菌株。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 形態觀察

準備牛肉膏蛋白胨平板,將分離得到的菌株涂布于上,在25℃條件下,培養2d,觀察長出的菌落形態、做革蘭氏染色反應和觀察細胞在電子顯微鏡下的形態。

1.3.2 16S rDNA的PCR擴增及序列測定

將劃線分離后的菌株,挑取單菌落,進行16S rDNA的PCR擴增,用0.1%的瓊脂糖凝膠對其PCR產物進行電泳,經過goldview染色后,在紫外下照射觀察PCR產物條帶情況,產物交測序公司測序［3］。

1.4 菌株的石油降解特性分析

準備牛肉膏蛋白胨的液體培養基,將活化后的菌株接種到其中,在25℃,200r/min的條件下,搖床富集培養12h,將其作為種子液。以5%的接種量（種子液）接入培養基中,25℃,200r/min的條件下培養,3h取一次樣,檢測培養基的OD600、PH和石油烴的濃度。

表2-1 菌株ST-1的生理生化測定Table2-1 Physiological and biochemical tests of the strain ST-1

圖2-3 菌株 ST-1的系統發育樹Fig.2-3 Phylogenetic tree of the strain ST-1

圖2-4 菌株不同生長階段的石油烴降解效果Fig.2-4 Effects of different growth stages of petroleum hydrocarbon degradation strains

為了考察溫度、PH值、接種量對石油烴降解的影響,進行了單因素實驗：

（1） 溫度：將種子液接種到培養基中,在15、20、25、30、35、40℃中培養,每隔24h,測其吸光度。

（2）PH值：將種子液接種到培養基中,用H2SO4或NaOH調節PH,在PH為3,4,5,6,7,8,9,的條件下培養,每隔24h,測其吸光度。

（3）接種量對石油烴降解的影響：分別取2ml、4ml、6ml、8ml接種于石油烴濃度為1000mg/L的培養基中,在25℃,200r/min下培養,每隔8h取樣測石油烴的濃度。

圖2-5 溫度對石油烴降解效果的影響Fig.2-5 The influence of temperature on the effect of petroleum hydrocarbon degradation

圖2-6 PH對石油烴降解效果的影響Fig.2-6 The influence of PH on the effect of petroleum hydrocarbon degradation

圖2-7 不同生物量條件下石油烴類的降解率Fig.2-7 The degradation of petroleum hydrocarbons under the conditions of different biomass ratio

2 結果與討論

2.1 形態特征

菌株在固體培養基上培養后得出結果為該菌的細胞為球狀,菌落呈圓形、黃色,表面光滑,不透明,邊緣整齊。

2.2 菌株的形態及生理生化測試

對該菌株進行常規生理生化特征鑒定,結果見表2-1。

2.3 系統發育樹的構建

將菌株的16S rDNA堿基的全序列輸入GenBank核酸序列數據庫,發現與假單胞菌屬10個菌株的同源性在 93%～94%,將與菌株ST-1同源性最高的菌株序列構建系統發育樹。由圖 2-3可見,這些同源性序列分為4個不同的分支,菌株 ST-1與Halomonas 位同于一個分支,并且這個分支的支持率達到90%,而其它的3個屬可以作為外群,菌株 ST-1定位于Halomonas屬,, 所以從這個聚類關系可以判斷, 菌株 ST-1屬于Halomonas的一個種。

2.4 菌株的石油烴降解特性

2.4.1 不同生長階段的石油烴降解特性

菌株在不同生長曲線下的石油烴降解曲線如圖2-4所示。

菌株4h后進入指數期,24h后進入穩定期。石油烴降解主要發生在指數期,24h時石油烴降解率達到81.3%,期間的最大石油烴降解速率達6.25mg/（Lh）；其后培養液中的石油烴濃度變化不大。菌株ST-1的延滯期短,生長速度快,這可能是其石油烴降解速率較高的主要原因之一［4,5］。

2.4.2 石油烴降解效果受環境因子的影響

前面所測的溫度和PH對菌株ST-1的石油烴降解效果的影響見圖2-5和2-6。在不同溫度下,菌株ST-1培養至12h時,其石油烴降解效果差異顯著,由于菌株的生長速度快,從而使石油烴降解作用也較快,本實驗測得30℃時去除效率是最高的,故此溫度下石油烴被降解的最多。在27～34℃內,石油烴降解速率均在80%以上,其中,在15～40℃時,石油烴都有不同程度的降解,表明菌株降解石油烴的溫度適應范圍較廣。

菌株ST-1的PH適應范圍較廣,在PH為6.8～8.3時,石油烴降解速率均達90%以上,但PH＜6時,石油烴降解效果急劇降低,這可能與菌株較能適應堿性環境的特性相關［6］。

2.4.3 菌株對石油烴降解效果的影響

本實驗從菌株的接種量對石油烴的降解效果來研究,從圖2-7可以看出,提高接種量可以加快反應速度,縮短延遲期,但接種量在6.0～8.0ml之間時,接種量對石油烴的降解速率影響不大,并且生物量越高,石油烴降解率迅速上升期也較短。

3 結論

（1）本實驗得到的菌株 ST-1在固體培養基上的生長特征、形態特征以及溫度適應性、pH值范圍等。通過 16S rDNA等分子生物學手段的鑒定可以初步判斷此菌種屬于Halomonas屬,且有可能為新種。

（2）本實驗對菌株ST-1對石油烴的降解進行了研究, 結果表明,石油烴降解發生在菌株生長的指數期,最大降解率達到80%以上, 降解的最適溫度為27～34℃,最適 pH為6.8～8.3,此時,最大降解速率達到90%以上。

（3）本實驗從菌株的接種量對石油烴的降解效果方面進行了研究,結果表明,提高接種量可以加快反應速度,縮短延遲期,但接種量達到一定值時,對石油烴的降解速率影響不大,并且生物量越高,石油烴降解率迅速上升期也較短。

［1］姚德明，許華夏.石油污染土壤生物修復過程中微生物生態研究［J］.生態學雜志，2002，21（1）：26～28.

［2］A tlas R.M.and Pramer D.Focus on Bioremediation［J］.ASM News，1990，56：7.

［3］Luo Peng， Hu Chaoqun， Zhang luping， et al. Effects of DNA extraction and universal primers on 16S rRNA gene-based DGGE analysis of a bacterial community from fish farming water［J］. Chinese Journal of Oceanology and Limnology.2007， 25：310-316.

［4］Plotnikova EG， Alyntseva OV， Kosheleva IA， et al. Bacterial degraders of polycyclic aromatic hydrocarbons isolated from salt-contaminated soils and bottom sediments in salt mining areas. Microbiology. 2001，70：51-58.

［5］鄧波等.生化法處理高溫高鹽油田采出水.中國給水排水，2003，194：76-78.

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1674-2060（2016）03-0315-02

秦春艷（1986—），女，碩士研究生，主要從事環境微生物的研究。