菜豆植物凝集素對腫瘤細胞增殖的抑制作用

金雯燕　韋思雨　李佳楠

摘 要 從已測定凝集素含量的56個菜豆品種中篩選具有代表性的菜豆品種，分離純化菜豆植物凝集素，MTS法分析其對人乳腺癌細胞（MCF7、231）及肝癌細胞（HEPG2）生長的影響。結果顯示菜豆植物凝集素能抑制這三種腫瘤細胞的增殖，且抑制作用呈明顯劑量-效應關系。說明菜豆植物凝集素具有一定的體外抗腫瘤活性，可進一步篩選高凝集素含量菜豆品種作為分離純化凝集素的原料，為抗腫瘤藥物的研究奠定實驗基礎。

關鍵詞 菜豆植物凝集素 MTS分析 抗腫瘤

中圖分類號：Q946 文獻標識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.09.079

Analysis on Inhibition of Tumor Cell Proliferation

Induced by Kidney Bean Lectin

JIN Wenyan，WEI Siyu， LI Jianan

Department of Biotechnology， School of Life Science， Jianghan University， Wuhan， Hubei 430056）

Abstract The kidney bean lectin was purified by methods of homogenization， centrifugation， ultrafiltration and ammonium sulfate precipitation. Two human breast cancer cell line （MCF7， 231） and one liver cancer cell line （HEPG2） were cultured in vitro and treated with kidney bean lectin. MTS assay was used for detecting the inhibition of tumor cell proliferation.The results showed that there was a significant difference in the inhibition ratio of proliferation after treated by kidney bean lectin. The result also indicated that the inhibition was dose dependent. This study will provide a theoretical basis and technical methods for the genetic improvement of kidney bean quality and utilization.

Key words kidney bean lectin； MTS assay； anti-tumor

凝集素是一種可從植物、無脊椎動物和高等動物中提取的糖蛋白或結合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質），故稱其為凝集素。有報道指出，某些凝集素在動物體內對各類腫瘤均有抑制作用；另有報道，從刀豆種子中提取的一種新型凝集素具有潛在的抗肝癌作用。多種研究表明存在于植物中的凝集素具有抑制腫瘤細胞增殖活性。

在前期研究中，我們已經對56個品種的菜豆植物凝集素進行活性濃度測定，并成功分離純化到菜豆植物凝集素，本研究擬通過MTS法檢測已分離的菜豆植物凝集素對三種腫瘤細胞生長的影響，判斷其是否具有抑制腫瘤細胞生長的作用，為菜豆植物凝集素的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人乳腺癌細胞（MCF7），人肝癌細胞（HEPG2），人乳腺癌細胞株（231）。

1.2 試劑

菜豆植物凝集素（1mg/ml），RPMI-1640培養基，胎牛血清，青、鏈霉素（1%），RPMI-1640完全培養液（RPMI-1640+10%胎牛血清+1%青、鏈霉素）。

1.3 方法

1.3.1 腫瘤細胞培養

三種貼壁細胞使用RPMI-1640完全培養液，于37.0€癈、5%CO2培養箱中培養。細胞貼壁生長，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3.2 MTS法檢測活細胞數

將用以上方法培養獲得的細胞以2.0x104個/ml密度接種于96孔培養板中，每孔0.1ml，于37.0€癈、5%CO2培養箱中培養24h后，加入濃度分別為1mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml的菜豆凝集素0.1ml。每個濃度設3個重復，并設空白對照。繼續培養24h后，加入MTS試劑，放回培養箱3～4h，在波長490nm處測得各孔吸光值，計算細胞生長抑制率=（空白對照組A490-實驗組A490）/空白對照組A490*100%。

1.4 統計學分析

利用EXCEL軟件，將吸光值與其相應的菜豆凝集素濃度制成統計圖進行分析。

2 結果

形態觀察結果顯示，人乳腺癌細胞（MCF7），人肝癌細胞（HEPG2），人乳腺癌細胞株（231）呈現相同生長趨勢：（1）正常培養時，傳代培養后3～4h可貼壁，并呈現長橢圓形；8-9h后，細胞緊密貼壁，形狀不一，呈拉扯狀多邊形貼合生長；24h后，細胞活躍生長，大量增殖。（2）加入了不同濃度的菜豆植物凝集素培養24h后，三種細胞生長狀況緩慢且貼壁完全不明顯，部分細胞變圓，甚至出現小細胞團。

MTS結果顯示（圖1）三種腫瘤細胞的生長均受菜豆植物凝集素抑制，且隨著凝集素濃度的依次增加（0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1mg/ml），抑制率依次增加，幅度變大（圖2、圖3、圖4），說明菜豆植物凝集素對這三種腫瘤細胞的抑制效應具有顯著量效依賴關系。

3 討論

植物凝集素是一類糖結合特異性非免疫性蛋白質的總稱，其本身具有多個催化性的糖結合結構域，通過專一性識別并結合細胞表面結構上的各種糖結構，引起細胞內部一系列反應，從而抑制細胞增殖，甚至讓細胞死亡。各類研究顯示植物凝集素對不同細胞系都具有體外凝血活性、抗增殖活性，對機體具有抗腫瘤，免疫激活以及抗菌抗病毒等生物活性。本研究結果亦顯示菜豆凝集素對三種腫瘤細胞的增殖有抑制作用。植物凝集素抑制細胞增殖的作用方式大致歸于兩大類：自噬與細胞凋亡途徑。自噬，指的是細胞本身的溶酶體將細胞膜內的物質降解，在細胞內基本細胞器被降解之后會導致細胞死亡。植物凝集素結合至細胞膜表面糖蛋白或多糖上，進而進入細胞內并大量附著于重要細胞器上，使其通透性改變，激活了自噬，溶酶體降解掉重要細胞器后，導致細胞死亡。細胞凋亡途徑中，caspase依賴途徑是較為普遍的一種類型。這種途徑中，最為關鍵的物質是caspase-3，因其底物為多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）和caspase以來的DNA酶抑制因子（ICAD）。而ICAD作為底物會被降解成含CAD的其他組分，CAD會導致DNA發生典型片段化，使細胞死亡。植物凝集素在進入細胞之后，會通過形成其他物質或改變膜電位等方式來激活caspase系列物質，最終激活caspase-3，導致細胞死亡。本研究中菜豆植物凝集素抑制腫瘤細胞增殖的作用機制還有待進一步研究。

*通訊作者：李佳楠

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