靈芝三萜化合物的抗腫瘤靶點預測與活性驗證

杜國華+王宏旭+閆征+劉莉瑩+陳若蕓

[摘要]研究發現靈芝三萜類化合物具有抗腫瘤活性，但其作用靶點尚不清楚，該試驗主要研究靈芝三萜類化合物的抗腫瘤活性并對其可能的作用靶點進行預測。采用Discovery Studio軟件的LibDock模塊，以靈芝子實體中的26種三萜類化合物作為配體，分別與抗腫瘤作用明確的11個靶點蛋白進行分子對接，獲得對接的打分結果，評判配體與靶點蛋白受體結合的親和力，從而進行靈芝三萜類化合物抗腫瘤的虛擬篩選，探討可能的作用靶點。同時，MTT實驗檢測26種靈芝三萜類化合物對5種腫瘤細胞的抑制能力，計算IC₅₀，以此反映化合物的抗腫瘤活性。對接結果表明，對接位置數目大于5，且對接得分高于100，可以作為判斷化合物是否具有活性的閾值，據此篩選出8種靈芝三萜類化合物可能具有抗腫瘤活性，其中5個具有多靶點作用的三萜成分。MTT細胞實驗顯示，靈芝酸Y對肺癌細胞H460顯示了一定的抑制活性，IC₅₀為22.4 μmol·L^-1，其次是7-oxo-ganoderic acid Z2，IC₅₀為43.1 μmol·L^-1。其他三萜類化合物對被測腫瘤細胞株未顯示活性或活性很弱。該研究建立的分子對接虛擬篩選方法可用于靈芝抗腫瘤活性成分的初步篩選，通過該方法的篩選，結合MTT細胞毒活性實驗結果，發現靈芝酸Y具有抗腫瘤，尤其抗肺癌開發的潛在可能性，7-oxo-ganoderic acid Z2和ganoderon B具有一定的抑制活性，其抗腫瘤作用有待于進一步深入研究，該研究結果可為抗腫瘤藥物的研制提供參考。

[關鍵詞]靈芝子實體； 三萜類化合物； 抗腫瘤； 分子對接； 虛擬篩選

[Abstract]It has reported that Ganoderma lucidum triterpenoids had anti-tumor activity. However， the anti-tumor target is still unclear. The present study was designed to investigate the anti-tumor activity of G. lucidum triterpenoids on different tumor cells， and predict their potential targets by virtual screening. In this experiment， molecular docking was used to simulate the interactions of 26 triterpenoids isolated from G. lucidum and 11 target proteins by LibDock module of Discovery Studio2016 software， then the anti-tumor targets of triterpenoids were predicted. In addition， the in vitro anti-tumor effects of triterpenoids were evaluated by MTT assay by determining the inhibition of proliferation in 5 tumor cell lines. The docking results showed that the poses were greater than five， and Libdock Scores higher than 100， which can be used to determine whether compounds were activity. Eight triterpenoids might have anti-tumor activity as a result of good docking， five of which had multiple targets. MTT experiments demonstrated that the ganoderic acid Y had a certain inhibitory activity on lung cancer cell H460， with IC₅₀ of 22.4 μmol·L^-1， followed by 7-oxo-ganoderic acid Z2， with IC₅₀ of 43.1 μmol·L^-1. However， the other triterpenoids had no anti-tumor activity in the detected tumor cell lines. Taking together， molecular docking approach established here can be used for preliminary screening of anti-tumor activity of G.lucidum ingredients. Through this screening method， combined with the MTT assay， we can conclude that ganoderic acid Y had antitumor activity， especially anti-lung cancer， and 7-oxo-ganoderic acid Z2 as well as ganoderon B， to a certain extent， had anti-tumor activity. These findings can provide basis for the development of anti-tumor drugs. However， the anti-tumor mechanisms need to be further studied.

[Key words]fruiting bodies of Ganoderma lucidum； triterpenoids； anti-tumor； molecular docking； virtual screening

靈芝Ganoderma lucidum（Leyss. Ex Fr）Karst.又稱瑞草、靈芝草，是靈芝屬藥食兩用真菌，世界各地均有分布，以熱帶和亞熱帶地區為多。我國靈芝藥用已有2 000多年的歷史，在《神農本草經》中，記載著赤芝、黑芝、紫芝等幾種靈芝的功效。大量藥理研究表明，靈芝具有調節免疫、抗腫瘤^[1-2]、抗衰老、提高機體耐缺氧能力等活性。其中研究較多的靈芝多糖具有抗腫瘤、抗氧自由基、抗衰老、提高免疫力、活血化瘀等多種生物活性。

近年來從靈芝中分離得到的另一類具有藥理活性的化學成分是三萜類化合物，是當今靈芝研究的一個熱點^[3-5]。三萜類化合物具有抗腫瘤^[6]、保肝排毒^[7]、抗微生物、鎮靜、抗疲勞、耐缺氧等多種藥理活性，但是確切的抗腫瘤活性作用機制尚不清楚，常規篩選和高通量篩選需要樣品制備和比較高的成本，而通過分子對接發現藥物的作用靶點簡單而高效，對確定化合物的靶點具有提示作用。因此，本研究主要針對中藥藥效弱、多靶點的特點，基于計算機虛擬篩選和細胞活性篩選技術，從靈芝三萜類化合物中篩選抗腫瘤活性的天然配體和可能的作用靶點，為靈芝抗腫瘤作用靶點研究提供理論基礎和參考。

1 材料

5種腫瘤細胞株，即肺癌細胞株H460、肝癌細胞株HepG2、胃癌細胞株BGC823、乳腺癌細胞株MDA-MB-231、結腸癌細胞株HCT116本實驗室保存，傳代培養。

靈芝三萜類化合物LZ1～LZ26，依次為靈芝酸A，B，靈芝烯酸A，B，靈芝酸C6，I，G，LM2，C2，C1，H，靈芝赤芝酸A，靈芝酸ε，M，AM1，J，靈芝烯酸G，赤芝酮B，D，F，靈芝烯酸H，靈芝酸AP3，Y，7-oxo-ganoderic acid Z， 7-oxo-ganoderic acid Z2和ganoderon B（也稱作lucidadiol）。由中國醫學科學院藥物研究所植化室課題組從赤芝中以高效液相色譜分離得到^[8]，并鑒定結構，純度≥98%。

RPMI 1640培養基購自Gibco公司，培養用胎牛血清（FCS，北京元亨圣馬生物技術研究所），MTT，0.25%胰酶購自Solabio公司，其他試劑均為國產分析純。所用溶液均用Milli Q水配制。酶標儀（Spectra Max190，美國MD公司）。

2 方法

2.1 小分子配體的準備 從Pubchem數據庫下載本文研究的三萜類化合物結構，導入軟件Discovery Studio 2016（DS2016）中。對于網站上不能查到的化合物，應用畫圖軟件ChemDraw Ultra 7.0畫出其結構，直接拷貝到DS中?？紤]到配體對映異構體等因素，采用DS中的Prepare Ligand處理該體系，通過此操作不僅可以對小分子的構象進行能量優化處理，產生三維結構，加氫，還可以產生異構體，26種三萜類化合物如此處理后產生81種用于對接的配體分子。

2.2 蛋白文件的處理 本文所用蛋白見表1，其晶體結構均源自Brookhaven（布魯克海文）蛋白質數據庫。使用DS2016軟件對這些蛋白進行除去水分子、去除蛋白多構象、補充非完整的氨基酸殘基、添加極性氫處理，最后給蛋白施加CHARMm力場得到用于對接的蛋白。

2.3 分子對接 以靈芝三萜類化合物為配體，以11個抗腫瘤作用的靶點為受體，利用DS2016軟件的LibDock模塊進行分子對接，對接的結果以打分函數Libdock Score給出。Libdock Score越高，預測小分子與受體結合的活性越高。另外通過DS2016軟件分析得到配體與受體的氫鍵數，找到對配體結合有重要貢獻的氨基酸殘基。

2.4 細胞毒活性實驗 對26種三萜類化合物的抗腫瘤活性試驗在肺癌細胞株H460、肝癌細胞株HepG2、胃癌細胞株BGC823、乳腺癌細胞株MDA-MB-231、結腸癌細胞株HCT116共5種細胞株上進行。將腫瘤細胞的細胞懸液按一定濃度接種于96孔培養板，置于37 ℃ 5%CO₂培養箱培養24 h。加 入待測化合物的工作液，其終濃度為0.1，1，10，100 μmol·L^-1（每個濃度4個復孔）。作用72 h后棄去

培養液，每孔加入100 μL含0.5 g·L^-1MTT的培養基。置于培養箱繼續培養4 h后棄液，每孔加入DMSO 150 μL，震搖10 min，使藍色結晶完全溶解，以檢測波長570 nm、參考波長655 nm于酶標儀測定每孔吸收值，計算IC₅₀。

3 結果

3.1 三萜化合物與靶點蛋白的對接 三萜化合物配體和靶點蛋白對接完成后產生對接位點數目（poses）和對接的得分（Libdock Score）。由對接結果可知，26種三萜類化合物與5種靶蛋白Bcl-x1， TNF-α， CDK2， FAK， PD-1均不能對接上，能與IL-2對接上的化合物很少且得分很低，只有靈芝酸C2和靈芝赤芝酸A 2種化合物能夠與Cox-2對接上，且得分比較高，但是對接位點數目很少。具體的分子對接結果見表2。

DS2016軟件的對接結果表明，對接位置數目大于5，且對接得分高于100的靈芝三萜類化合物有8種，LZ-1，11，12，17，23～26，對接效果好的這些三萜類化合物可能具有抗腫瘤活性，其中LZ-12，23～26這5種三萜類化合物可能存在多靶點作用。

尤其以靈芝酸Y（LZ-23）與EGFR的對接效果最好，因此對其作進一步分析。靈芝酸Y與EGFR的分子對接效果見圖1。由二維平面圖1B可知，靈芝酸Y側鏈羧基上的羥基與Asp855殘基存在明顯的氫鍵作用，氫鍵距離為1.83，靈芝酸Y側鏈羧基上的羰基氧原子也與Asp855，His835 2個殘基之間具有明顯的相互作用，推測共軛雙鍵的存在促進化合物與周圍氨基酸形成氫鍵和其他相互作用。靈芝酸Y還與殘基Phe723，Phe856分別形成了π鍵-烷基化作用。另外，靈芝酸Y處于Arg841，Phe723，Arg858，Phe856，Leu799等氨基酸殘基的包圍之中，存在多個烷基化作用，推斷可能是因為這些殘基與配體的相互作用增強了配體與受體的結合能力，從而使該配體化合物的活性提高。

3.2 細胞毒活性實驗 26種靈芝三萜類化合物對實驗測試的5種腫瘤細胞株的IC₅₀列于表3。實驗結果顯示，26種化合物單體對5種被測腫瘤細胞株的抑制作用顯著不同。靈芝酸A，靈芝酸Y，7-oxo-ganoderic acid Z，7-oxo-ganoderic acid Z2和ganoderon B表現出細胞毒活性，其中靈芝酸A只對HCT116細胞株表現出弱活性；靈芝酸Y對 腫瘤細胞H460，BGC823，HCT116具有一定的抑制活性，7-oxo-ganoderic acid Z2對H460有一定的抑制活性（IC₅₀<50 μmol·L^-1）；尤其靈芝酸Y對肺癌細胞株H460的細胞毒活性最強，IC₅₀為22.4 μmol·L^-1。而其他化合物對所有被測細胞株都沒有表現出細胞毒活性（IC₅₀>100 μmol·L^-1）。

4 討論

針對中藥抗腫瘤治療體現出藥效弱、多靶點作用的特點，本文對靈芝三萜成分的抗腫瘤作用進行了多靶點的計算機虛擬篩選和MTT法體外篩選兩方面的研究。

對接結果顯示，ganoderon B和7-oxo-ganoderic acid Z可以與EGFR， VEGFR2， FTase， PPARγ 4個靶蛋白的多個位點能夠對接上，且對接位置的數目大于5，對接打分高于100，7-oxo-ganoderic acid Z2的對接情況與之相似，推斷這3種化合物可能會與這4個靶點作用，因此，細胞水平表現出弱活性的試驗結果，文獻[9]研究結果顯示，7-oxo-ganoderic acid Z對HepG2的LC₅₀為22.08 μmol·L^-1，這些是相符的。而靈芝酸Y與EGFR靶點對接良好，對接位置的數目多達19，得分高達122.02，與PPARγ和FTase 2個靶點對接稍弱些，MTT實驗結果靈芝酸Y卻表現出比較強的細胞毒活性，推測靈芝酸Y的作用靶點可能是EGFR， PPARγ或FTase。但是靈芝酸A， H， 靈芝烯酸G與FTase的對接位置數目和對接打分比較高，靈芝赤芝酸A與FTase和PPARγ的對接也比較好，但是它們幾乎沒有表現出細胞毒活性，原因可能是測定細胞的這種受體表達不高所致。據此，可以推斷靈芝酸Y對H460的作用靶點可能主要是EGFR，而靈芝酸A， H， 靈芝烯酸G的作用靶點可能是FTase，可以通過進一步的實驗來證明確切的作用靶點。

Chen Chun-Ru等^[6]對從赤芝子實體中分離到的46個三萜成分的細胞毒活性進行了評價，結果顯示lucidadiol對海拉癌細胞株有很強的細胞毒活性，其IC₅₀為5 μmol·L^-1。而本實驗ganoderon B對腫瘤細胞株顯示弱的細胞毒活性，這可能是因為不同的腫瘤細胞的敏感度和受體表達不同導致的。

靈芝赤芝酸A與PPARγ和FTase 2個靶點的對接位置數目大于5，對接得分高于100，但是細胞實驗結果卻沒有表現出細胞毒活性，對此，還需要其他的實驗加以驗證。

而其他三萜化合物對接結果顯示結合弱，體外5種細胞的MTT實驗結果也沒有顯示活性，2種方法的結果相吻合。事實上，文獻[10]研究結果也表明，三萜化合物靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸I、靈芝酸G、靈芝酸H基本沒有細胞毒活性或者活性很弱，其中靈芝酸B對HepG2的IC₅₀為0.65 g·L^-1，相當于1.258 mmol·L^-1，靈芝酸I對HepG2的IC₅₀為0.26 g·L^-1，相當于0.488 mmol·L^-1，結果是相符的。

從結構上看，化合物靈芝酸Y、7-oxo-ganoderic acid Z和7-oxo-ganoderic acid Z2的側鏈上含有共軛雙鍵，結果表現出一定的生物活性，ganoderon B側鏈上含有一個不共軛的雙鍵，其活性相對弱一些，而其他22種三萜化合物不具備這種結構，也幾乎沒有表現出細胞毒活性，見圖2。因此，推測靈芝三萜結構中側鏈上與羧基共軛的雙鍵可能是活性基團，對化合物活性貢獻比較大。

靈芝酸Y活性最好，主要是其結構除了側鏈含有共軛雙鍵活性基團外，母核上還含有一對共軛烯鍵，使得靈芝酸Y分子與靶點蛋白氨基酸殘基易于形成了π鍵-烷基化作用，見圖1，從而表現出比較好的活性。

綜上，通過分子對接可以預測化合物的作用靶點，初步篩選活性化合物，利用細胞毒活性實驗進一步驗證化合物活性，為靈芝三萜化合物的抗腫瘤研究提供理論依據。

5 結論

26種靈芝三萜類化合物在同一種細胞株上表現出顯著不同的抑制作用，這與化合物的結構有關，側鏈上的雙鍵，尤其是共軛雙鍵是活性基團，能夠使得側鏈羧基容易與氨基酸殘基形成氫鍵，從而表現出比較強的活性。

通過計算機虛擬篩選和體外細胞毒活性測試發現靈芝酸Y對肺癌細胞H460表現出較強的細胞毒活性，是本研究初步篩選出的比較有潛力的抗腫瘤化合物。但是三萜成分抗腫瘤機制復雜，有待于進一步深入研究。

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[責任編輯 丁廣治]