胡桃楸總鞣質的小鼠體內抗腫瘤作用研究

王添敏　俞文婕　付瑩

[摘要] 目的 研究胡桃楸總鞣質的體內抗腫瘤活性。 方法 采用70%丙酮超聲提取胡桃楸中總鞣質。采用荷H22肝癌實體瘤小鼠模型評價胡桃楸的抗腫瘤活性。將50只ICR小鼠隨機分為正常組，模型組，環磷酰胺陽性對照組，總鞣質低、高劑量組，每組各10只。正常組小鼠右腋下接種PBS（0.2 mL/只），其余各組小鼠均于右腋下接種等體積的小鼠H22肝癌細胞懸液（2×106個/mL）。接種24 h后給藥，總鞣質低（0.09 g/kg）、高劑量（0.18 g/kg）組分別灌胃給予低濃度和高濃度的總鞣質提取物，陽性對照組腹腔注射環磷酰胺生理鹽水溶液（0.03 g/kg），正常組和模型組灌胃給予等體積的蒸餾水。連續給藥10 d后，處死小鼠，以瘤重和抑瘤率為指標研究胡桃楸總鞣質對H22肝癌實體瘤的抑制作用，以免疫器官指數、外周血象和肝功能為指標研究胡桃楸總鞣質對荷瘤機體生存質量的影響。 結果 胡桃楸總鞣質的得率為5.07%，純度為92.8%。與模型組比較，胡桃楸總鞣質低、高劑量組腫瘤重量明顯降低（P < 0.05），均顯示較明顯的抗腫瘤作用，抑瘤率分別為34.22%和36.92%。在抑制腫瘤生長的同時，胡桃楸總鞣質未顯示環磷酰胺所致的體重降低、免疫抑制和殺傷白細胞等副作用。 結論 胡桃楸總鞣質具有較好的抗腫瘤作用，且無免疫抑制和殺傷白細胞等副作用。

[關鍵詞] 胡桃楸；總鞣質；小鼠肝癌；抗腫瘤

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（c）-0016-04

[Abstract] Objective To evaluate the in vivo anti-tumor activity of the total tannins from Juglans mandshurica. Methods Total tannins from Juglans mandshurica was extracted by 70% acetone. Mice bearing murine-hepatocarcinoma （H22） model was established to evaluate the anti-tumor activity. Totally 50 ICR mice were randomly divided into five groups with 10 mice in each group： normal control group， model control group， cyclophosphamide group （as positive control）， and total tannins low， high dose group. The normal control group was subcutaneously injected with PBS （0.2 mL per mouse）， while the other four groups were subcutaneously injected with murine-hepatocarcinoma （H22） cell suspension （2×106/mL）. 24 h after injection， total tannins low， high dose group was intragastrically administered with total tannins at low （0.09 g/kg） and high dosage （0.18 g/kg）. Cyclophosphamide group was given with cyclophosphamide （0.03 g/kg） by intraperitoneal injection. Normal and model control groups were intragastrically administered with water. After continuous administration for 10 d， killed mice， tumor weight and tumor inhibition ratio were obtained for the evaluation of the anti-tumor activity. Immune organ index， hematological parameters and Hepatic functions were determined to estimate the protective effects of total tannins on normal functions of H22 tumor bearing mouse. Results The yield of tannins from Juglans mandshurica was 5.07%， and the purity of the tannins was 92.8%. Total tannins from Juglans mandshurica showed inhibitory effect on the growth of tumor tissues. The inhibitory ratio of total tannins low and high dose group were 34.22% and 36.92%， respectively. Total tannins from Juglans mandshurica did not exhibit side effects， which are typical of cyclophosphamide， such as loss of body weight， immune suppression and killing white blood cell. Conclusion Total tannins from Juglans mandshurica was effective in anti-tumor， and did not exhibit side effects of immune suppression and killing white blood cell.

[Key words] Juglans mandshurica； Total tannins； Murine-hepatocarcinoma； Anti-tumor activity

胡桃楸（Juglans Mandshurica Maxim.）為胡桃科（Juglandaceae）植物，屬落葉喬木，在我國東北和華北地區資源豐富。根據文獻記載，胡桃楸具有補肺益腎、滋陰助陽和抗癌等功效[1-2]，民間采用胡桃楸的水煎劑治療腫瘤[3]。胡桃楸中主要含有鞣質和萘醌類成分[4-6]，但是經過加熱后，其中的萘醌類成分多已揮發[7]，水煎劑中主要含鞣質類成分。有學者研究表明，胡桃楸中的鞣質類化合物前體沒食子酸[8]和逆沒食子酸[9]能夠抑制腫瘤細胞的增殖。因此，本實驗制備了胡桃楸總鞣質提取物，研究了胡桃楸總鞣質的抗腫瘤作用，為胡桃楸的抗腫瘤藥效物質基礎研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試藥 胡桃楸枝樣品于2011年7月采自遼寧省普蘭店市蓮山鎮，由遼寧中醫藥大學翟延君教授通過原植物形態和性狀特征鑒定為胡桃科植物胡桃楸Juglans mandshurica Maxim.。標本編號201107ZHI01，保存于遼寧中醫藥大學研發中心F205。

陽性對照環磷酰胺（cyclophosphamide）純度>98%，購于大連美侖生物，批號20130326。

1.1.2 實驗動物和瘤株 SPF級ICR小鼠，6～8周齡，體重（18～22 g），雌雄各半，購于大連醫科大學實驗動物中心，合格證號：SCXX（遼）2012-0002。飼養于本實驗室動物飼養室，環境溫度20～25℃、濕度40%～60%。H22小鼠肝癌瘤株購自南京凱基生物科技發展有限公司。

1.1.3 儀器和試劑 胎牛血清、PBS緩沖液和RPMI-1640培養基購自美國Gibco生命技術有限公司。ALPHA1-4LSC冷凍干燥機購自德國Marin christ公司，YXQSG46-280壓力蒸汽消毒器購自寧波久興醫療器械有限公司，HD2-BCN-1360B生物潔凈工作臺購自哈爾濱東聯電子技術有限公司，NUAIRE AUTOFLOW CO2培養箱購自美國紐艾公司。BC-2600vet全自動血液分析儀購自邁瑞公司，7020全自動生化分析儀購自株式會社日立制作所。

1.2 方法

1.2.1 胡桃楸總鞣質的制備 胡桃楸莖枝切片后冷凍干燥、粉碎、過40目篩。取胡桃楸莖枝粉末100 g于錐形瓶中，加10倍體積的70%丙酮，超聲提取40 min，冷凝水維持水溫20℃，濾過，濾液轉移至圓底燒瓶中，回收溶劑至無丙酮味，冷凍干燥。密封保存于4℃冰箱中。臨用前用蒸餾水配置成低（9 mg/mL）、高（18 mg/mL）2種不同濃度的溶液。

1.2.2 胡桃楸總鞣質純度的測定 精密稱取胡桃楸總鞣質提取物25 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液。按照本課題組建立的方法[10]分別測定供試品溶液中總多酚和游離多酚的含量，計算總鞣質的含量。從而計算胡桃楸總鞣質提取物的純度。

1.2.3 小鼠H22肝癌實體瘤模型的建立 取-80℃下凍存的H22小鼠肝癌細胞，按常規方法進行復蘇和小鼠體內傳代培養。無菌條件下剖取體內傳至第四代，接種7 d生長良好的H22肝癌小鼠腹水，用PBS稀釋9倍后計數，臺酚藍拒染法測定細胞活性，活細胞率≥95%，并根據計數結果調整離心管中的腹水濃度，使細胞濃度為2×106個/mL。吸取細胞懸液，以0.2 mL/只注射于小鼠右腋下[11-12]。

1.2.4 分組和給藥 接種24 h后，將小鼠完全隨機分為4組，每組10只。模型組灌胃給予蒸餾水，總鞣質低（0.09 g/kg）、高（0.18 g/kg）劑量組分別灌胃給予低濃度（9 mg/mL）和高濃度（18 mg/mL）的總鞣質提取物，陽性對照組腹腔注射環磷酰胺生理鹽水溶液（3 mg/mL）。另設10只右腋下注射0.2 mL/只PBS的ICR小鼠作為正常組，灌胃給予蒸餾水。各組小鼠分籠喂養，自由飲水與攝食，每天給藥1次，灌胃和腹腔注射體積均為10 mL/kg，連續給藥10 d。

1.2.5 血液樣品的處理 末次給藥24 h后，稱小鼠體重，眼眶靜脈叢采血。在采集的過程中將其分成兩部分：約0.1 mL靜脈血收集于吸附有EDTA-二鉀的EP管，做為抗凝血；剩余血液直接收集于EP管中，做為非抗凝血。

抗凝血檢測小鼠白細胞數目、血小板數目和血紅蛋白含量等血象指標。非抗凝血靜置30 min，37℃水浴孵育30 min，850轉/min，離心10 min，用移液槍吸取血清，檢測各組小鼠血清中總蛋白、白蛋白和堿性磷酸酶等肝功能指標。

1.2.6 組織樣品的收集與處理 小鼠采血后，頸椎脫臼處死，剝離腫瘤，剖取胸腺、脾臟，稱量各組織重量并記錄。計算各組抑瘤率、10 g體重胸腺指數和10 g體重脾臟指數。計算方法如下：

抑瘤率（%）=（模型組瘤重-實驗組瘤重）/模型組瘤重×100%，

胸腺指數=10×胸腺重（mg）/體重（g）×100%，

脾臟指數=10×脾臟重（mg）/體重（g）×100%。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 19.0對數據進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胡桃總鞣質的純度

根據鞣質易溶于丙酮的性質，采用70%丙酮超聲提取，胡桃楸總鞣質的得率為5.07%。采用磷鉬鎢酸顯色的方法測定胡桃楸總鞣質中鞣質的含量為928.01 mg/g，胡桃楸總鞣質的純度為92.8%。

2.2 胡桃楸總鞣質對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

模型組小鼠平均瘤重為1.23 g，模型建立成功。胡桃楸總鞣質對H22荷瘤小鼠腫瘤生長具有顯著抑制作用（圖1、表1），低、高劑量組小鼠的瘤重顯著低于模型組（P < 0.05），抑瘤率分別為34.22%和36.92%。陽性對照組小鼠的瘤重也顯著低于模型組（P < 0.05），抑瘤率達91.52%。

2.3 胡桃楸總鞣質對H22荷瘤小鼠免疫器官和體重的影響

與正常組比較，模型組小鼠的胸腺指數顯著降低（P < 0.05）（表1）。胡桃楸總鞣質低劑量組的胸腺指數仍顯著低于正常組（P < 0.05），而總鞣質高劑量組的胸腺指數則趨于正常，與正常組無統計學意義差異（P > 0.05）。模型組小鼠的脾臟指數略高于正常組，但差異無統計學意義（P > 0.05），胡桃楸總鞣質低、高劑量組小鼠的脾臟指數也與正常組無統計學意義差異（P > 0.05）。

實驗結束時，陽性對照組小鼠的體重降低（表1），其余各組小鼠體重均正常增長，各組之間差異無統計學意義（P > 0.05）。陽性對照組小鼠的胸腺指數和脾臟指數均顯著低于模型組和正常組（P < 0.05）。

2.4 胡桃楸總鞣質對H22荷瘤小鼠外周血象的影響

模型組小鼠的白細胞數顯著高于正常組（P < 0.05）。給予不同劑量的胡桃楸總鞣質后，總鞣質高劑量組小鼠白細胞數接近正常水平，與正常組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

模型組小鼠的血小板數顯著高于正常組小鼠（P < 0.05）。給予不同劑量的胡桃楸總鞣質后，血小板數有降低的趨勢，其中總鞣質高劑量組小鼠的血小板數與正常組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

模型組小鼠血紅蛋白含量顯著低于正常組小鼠（P < 0.05）。給予不同劑量的胡桃楸總鞣質和環磷酰胺后，各組小鼠血紅蛋白含量仍顯著低于正常值（P < 0.05）。見表2。

環磷酰胺組小鼠的總白細胞數目顯著低于正常組、模型組和其他給藥組（P < 0.05）。見表2。

2.5 胡桃楸總鞣質對H22荷瘤小鼠肝功能的影響

模型組小鼠與正常組小鼠比較，總蛋白、白蛋白、白球比和堿性磷酸酶含量顯著降低（P < 0.05）（表3），荷瘤小鼠可能存在肝功能損傷。給予不同劑量的胡桃楸總鞣質和環磷酰胺后未見顯著好轉，推測胡桃楸總鞣質和環磷酰胺對小鼠因荷瘤而引起的肝功能損傷無明顯改善作用。

3 討論

民間采用胡桃楸水煎液治療腫瘤[3，13]，關于胡桃楸的抗腫瘤研究較多[14-17]。胡桃楸中主要成分包括萘醌和鞣質[4-6]。有文獻報道胡桃楸中胡桃醌等萘醌類成分具有抗腫瘤作用[18]，但胡桃醌不穩定[6，19]，胡桃楸水煎液中檢測不到胡桃醌，而主要含有鞣質類成分。未見文獻報道胡桃楸鞣質的抗腫瘤作用，因此本文采用70%丙酮超聲提取胡桃楸中總鞣質，對其抗腫瘤作用進行了研究。

結果顯示胡桃楸總鞣質具較好的抗腫瘤作用，低劑量和高劑量的抑瘤率分別為34.22%、36.92%。胡桃楸總鞣質低（0.09 g/kg）、高劑量（0.18 g/kg）的抑瘤率接近，在預實驗中測定了胡桃楸總鞣質劑量為0.18 g/kg和0.36 g/kg時，抑瘤率分別為40%和5%。本文和預實驗的結果說明胡桃楸總鞣質的抗腫瘤作用不呈量效關系，高劑量時抑瘤率增加不明顯（0.18 g/kg）甚至降低（0.36 g/kg）。這可能由于胡桃楸總鞣質中成分復雜，其中含有抗腫瘤的成分，也可能含有促進腫瘤生長的成分。低劑量（0.09 g/kg）時，抗腫瘤的成分發揮主要作用，而促進腫瘤生長的成分作用較弱；高劑量（0.18 g/kg）時，抗腫瘤的成分發揮主要作用，促進腫瘤生長的成分也發揮了一定作用，使得該劑量的抑瘤率與低劑量接近；更高劑量（0.36 g/kg）時，促進腫瘤生長的成分發揮了主要作用，造成該劑量的抑瘤率反而降低。因此，有必要深入研究并尋找胡桃楸總鞣質中的抗腫瘤有效成分，剔除無效成分。

陽性對照（環磷酰胺）組小鼠的胸腺指數和脾臟指數均顯著低于模型組和正常組（P < 0.05），說明環磷酰胺具有明顯副作用。同時環磷酰胺組小鼠的總白細胞數目顯著低于正常組、模型組和其他給藥組（P < 0.05），這與臨床上環磷酰胺殺傷白細胞的副作用一致[20-23]。以上說明環磷酰胺雖較胡桃楸總鞣質具有較高的抑瘤率，但具有明顯的副作用，能使小鼠體重降低、白細胞數減少、免疫器官指數降低。

在機體正常功能方面，胡桃楸總鞣質低、高劑量組小鼠體重、免疫器官指數與正常組小鼠無顯著差異（P > 0.05），白細胞數目未減少。胡桃楸總鞣質高劑量還能改善荷瘤小鼠血紅蛋白含量降低、血小板數目升高的癥狀。說明胡桃楸總鞣質在抑制腫瘤生長的同時無明顯的副作用，具有天然抗腫瘤藥物副作用低的優勢，值得深入研究其抗腫瘤有效成分或有效組分。

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（收稿日期：2016-11-14 本文編輯：蘇 暢）