NK細胞在HBV感染中的作用研究

屈曉晶 李明慧 曹衛華 張丹 張璐 路遙 胡蕾蘋 吳淑玲 華文浩 宋淑靜 劉順愛 謝堯 吳疆 成軍

100015 北京，首都醫科大學附屬北京地壇醫院肝病中心(屈曉晶、李明慧、曹衛華、張丹、張璐、路遙、胡蕾蘋、吳淑玲、華文浩、宋淑靜、劉順愛、謝堯、成軍)；100013 北京，北京疾病預防控制中心(吳疆)

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·論著·

NK細胞在HBV感染中的作用研究

屈曉晶 李明慧 曹衛華 張丹 張璐 路遙 胡蕾蘋 吳淑玲 華文浩 宋淑靜 劉順愛 謝堯 吳疆 成軍

100015 北京，首都醫科大學附屬北京地壇醫院肝病中心(屈曉晶、李明慧、曹衛華、張丹、張璐、路遙、胡蕾蘋、吳淑玲、華文浩、宋淑靜、劉順愛、謝堯、成軍)；100013 北京，北京疾病預防控制中心(吳疆)

目的 自然殺傷(natural killers, NK)細胞是淋巴細胞的重要組成，屬于固有免疫的一部分。在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染過程中，NK細胞既發揮抑制病毒復制的作用，同時又可引起肝組織損傷。對于NK細胞在HBV感染過程中的具體作用，目前還存在很大爭議。方法 該研究比較了49例慢性HBV感染免疫清除期(immune clearance phase，IC)、32例急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)、30例慢性HBV感染免疫耐受(immune tolerance phase，IT)患者及13例健康對照(health control, HC)的外周血NK細胞、CD56bright群、CD56dim群和NK細胞表面受體IFNAR2、NKp46的表達情況以及細胞因子IL-10、TGFβ1、IFNα2、IFNγ的含量，并分析了它們與ALT、HBV DNA的關系。結果 IC和AHB組CD3-CD56+NK細胞頻數降低，主要發揮細胞毒作用的CD56dim群的頻數也減少，而主要分泌IFNγ的CD56bright群卻升高。不一致的，外周血IFNγ含量卻沒有相應升高，相反，還明顯降低。與HC組比，在IT組并沒有發現NK細胞及其亞群頻數的明顯改變?？梢种芅K細胞產生IFN-γ的IL-10在IC和AHB組升高，同樣升高的還有另一種抑制性細胞因子TGFβ1。IC組IFNα2分泌增加而且NK細胞IFNAR2的表達上調。IT組雖然NK細胞IFNAR2表達上調，但是外周血IFNα2分泌量明顯不足。AHB組IFNα2分泌水平和健康對照相近。ALT與HBV DNA在IC患者呈負相關，在AHB組呈正相關。IC組HBV DNA含量與IFNAR2的表達水平呈正相關。結論 NK細胞在免疫清除期患者和急性乙型肝炎患者受到抑制，這種抑制可能有助于減輕肝臟損傷。在免疫清除期患者和急性乙型肝炎患者NK細胞的細胞毒性功能被保存，但分泌細胞因子能力受損。免疫耐受期患者可能是IFNα2分泌不足，不能有效的激活NK細胞，導致HBV長期存在。急性乙型肝炎患者HBV的清除可能依賴非IFNα2途徑。ALT可作為評估免疫清除期患者免疫清除HBV水平的指標。急性HBV感染時，病毒的快速擴增可能是導致肝臟損傷的機制。另外，在免疫激活時，HBV可能刺激NK細胞上IFNAR2的表達。

Fundprograms:NationalNaturalScienceFundationofChina(81071344);BeijingScienceandTechnologyCommissionMajorProject(D121100003912001)

乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染是世界范圍的公共健康問題，它是引發慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一[1]。HBV感染人體的過程，是病毒及其所合成的蛋白、顆粒與人體免疫系統復雜的相關作用的過程，最終導致病毒清除或急、慢性肝臟疾病。成人感染HBV后多數表現為急性、自限性(>95%)，不表現出明顯的臨床癥狀，但新生兒感染后多數進展為慢性感染(>90%)，早期觀點認為這與新生兒免疫系統不成熟有關，但最近認為可能是HBV-特異性T細胞功能缺陷導致HBV感染的慢性化[2、3]。NK細胞作為固有免疫的重要組成，不但在抗病毒和腫瘤細胞方面發揮非常重要的作用，而且還有免疫防衛、免疫監視和免疫平衡的作用。在此，我們比較了不同HBV感染患者外周血NK細胞及其亞群，NK細胞表面功能分子及相關細胞因子的變化，并分析了它們與ALT、HBVDNA的關系，從而有助于我們了解NK細胞在HBV感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 患者和健康受試者 本研究入選了2014年9月至2016年1月到首都醫科大學附屬北京市地壇醫院就診的111位患者,13位首都醫科大學附屬北京地壇醫院的職工做為健康對照(HC)?；颊呖筛鶕﨟BV感染的不同階段分為三組：慢性HBV感染免疫清除組(IC)、急性乙型肝炎組(AHB)和慢性HBV感染免疫耐受組(IT)，診斷標準參考文獻[3-5]。受試者特點如表1。排除標準：除外HBV外的其他肝炎病毒及HIV感染患者，除外藥物、酒精、自身免疫等原因所致的肝炎患者。本研究通過首都醫科大學附屬北京市地壇醫院倫理委員會通過，所有患者簽署知情書。

1.2 細胞表面染色和流式細胞儀分析 抽取患者及健康人抗凝全血，4h內染色上機。為了檢測CD3-CD56+NK細胞，在100μl全血中加入PerCPMouseanti-HumanCD3(美國BD公司)，APCMouseanti-HumanCD56(美國BD公司)，PEanti-HumanCD335(NKp46,Biolegend公司)，Anti-HumanIFNAR2Antibody(FITC，SinoBiologicalInc)避光孵育15min。染色后的細胞用FACSLysingSolution(美國BD公司)裂解紅細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，流式細胞儀(美國BD公司)檢測和FlowJo7.6(美國)分析。

1.3Luminex和ALT、HBVDNA檢測 抽取患者及健康人抗凝全血高速離心，留取血漿-80 ℃凍存。血漿中細胞因子送檢，檢測試劑為Luminex試

表1 受試者特征

注：縮寫：IC，免疫清除；AHB，急性乙型肝炎；IT，免疫耐受；HC，健康對照；NA，不適用；SEM，均值的標準差

Note: Abbreviations: IC, immune clearance；AHB, acute hepatitis B; IT, immune tolerance phase; HC, health control; NA, not applicable; SEM, standard error of mean

圖1 外周血CD3-CD56+NK細胞、CD56bright群和CD56dim群在IC、AHB、IT和HC組所占的頻數Fig.1 Frequency of CD3-CD56+NK cells, CD56brightsubset and CD56dimsubset in IC,AHB,IT and HC

劑盒(德國默克密理博公司)，內容包括IL-10、TGF-β1、IFNα2、IFNγ等。ALT、HBV DNA由首都醫科大學附屬北京地壇醫院檢驗科提供。

1.4 統計學方法 所有數據以均數±標準差或box-and-whisker plots呈現,利用GraphPad Prism 5分析。不同組間多重比較用Kruskal-Wallis H 非參數分析，多組間兩兩比較用Mann-Whitney U 檢驗。變量的相關性分析用Spearman等級相關檢驗。*P<0.05,***P<0.001。P<0.05被認為有意義。

2 結果

2.1 CD3-CD56+NK細胞頻數 與IT組和HC組相比，IC組外周血CD3-CD56+NK細胞頻數明顯降低，AHB組CD3-CD56+NK細胞頻數降低幅度和IC組基本一致(圖1 A)。與IT組和HC組相比，在IC組和AHB組CD56bright群頻數升高(圖1 B)，CD56dim群頻數降低(圖1 C)。與HC相比，IT組CD3-CD56+NK細胞頻數無明顯變化。

2.2 NK細胞受體IFNAR2表達 與HC和IT組比，IC組NK細胞表面IFNAR2表達水平升高。與HC比，AHB組NK細胞IFNAR2表達水平同樣升高(圖2 B)。與HC比，NK細胞另一個重要激活受體NKp46在其他3組升高不明顯(圖2 A)。

圖2 NK細胞表面受體NKp46和IFNAR2在IC、AHB、IT和HC組的表達水平Fig.2 The expression level of surface receptors IFNAR2 and NKp46 on NK cells in IC,AHB,IT and HC

2.3 IFNα 2在IC組含量升高，但IFNγ在IC和AHB組明顯降低 與HC和IT組比，IC組外周血IFNα 2含量升高(圖3 A),但IFNγ卻沒有相應的升高，相反還有所減少(圖3 B)。與HC比，IT組無論IFNα2還是IFNγ含量都降低(圖3 A-B)。與HC比，AHB組外周血IFNα2含量并沒有明顯減少(圖3 A),但IFNγ含量卻明顯降低(圖3 B)。

2.4 IL-10和TGFβ1在AHB組明顯升高 與HC比，AHB組外周血IL-10含量升高，IC組和IT組卻明顯降低(圖3 C)。但與IT組比，IC組IL-10升高(圖3 C)。AHB組外周血TGFβ1含量比其他3組明顯升高(圖3 D)。與HC比，IC組TGFβ1含量輕度升高，但比IT組低(圖3 D)。

圖3 外周血IFNα2、IFNγ、IL-10和TGFβ1在IC、AHB、IT和HC組的分泌水平Fig.3 The secretion level of IFNα2,IFNγ,IL-10 and TGFβ1 in the peripheral blood

圖4 HBV DNA與ALT分別在IC組和AHB組相關性分析以及HBV DNA與IFNAR2表達水平在IC組的相關性分析Fig.4 The correlation analysis of serum HBV DNA load and ALT in IC and AHB. The correlation analysis of HBV DNA and the expression level of IFNAR2 on NK cells

2.5 ALT與HBV DNA在IC患者呈負相關，在AHB組呈正相關 在IC組，ALT與HBV DNA呈負相關(圖4 A)。在AHB組，ALT與HBV DNA呈正相關(圖4 B)，然而在HC和IT組并沒有發現ALT與HBV DNA具有相關性。分析也并沒有發現ALT與NK細胞、NKp46、IFNAR2、IL-10、TGF-β1、IFNα2及IFNγ在4組具有相關性(數據沒有呈現)。有趣的是，我們發現在IC組HBV DNA含量與IFNAR2的表達水平呈正相關(圖4 C)。

3 討論

在急性乙型肝炎患者的研究顯示，NK細胞在HBV感染初期被優先激活，但在HBV DNA降低時NK細胞開始減少[6]，因此認為NK細胞不但與HBV清除而且還與肝臟損傷有關。我們的研究發現急性乙型肝炎患者NK細胞頻數降低，可能由于患者就診不及時所致。與以前的研究結果一致[4、7、8]，我們的結果也提示NK細胞在免疫清除期患者和急性乙型肝炎患者受到抑制，這種抑制可能是抑制性細胞因子IL-10和TGF-β1分泌增加引起，而且在急性乙型肝炎時明顯增多，從而有助于減輕肝臟損傷。

有研究顯示，在慢性HBV感染，NK細胞的細胞毒功能增強，但分泌細胞因子能力減弱，這可能是病毒不能被清除的原因[9]。我們研究顯示，在免疫清除期患者和急性乙型肝炎患者主要發揮細胞毒作用CD56dim群的頻數減少，而主要分泌IFNγ的CD56bright群升高。不一致的，外周血IFNγ含量卻沒有相應升高，相反，還明顯降低。而且研究顯示，IL-10可抑制NK細胞產生IFNγ，但是不會抑制NK細胞的細胞毒作用。因此，我們推測在免疫清除期患者和急性乙型肝炎患者NK細胞的細胞毒性功能被保存，但分泌細胞因子能力受損。在免疫耐受患者并沒有發現NK細胞及其亞群頻數的明顯改變。IL-10升高導致的免疫抑制可能與HBV不能清除及疾病進展相關[8]。然而，IFNγ分泌減少也可能與另一個分泌IFNγ的HBV特異性CD8+T細胞功能受損有關，有研究表明NK細胞限制CD8+T細胞的免疫反應，包括產生IFNγ的能力[10]。最新研究顯示，通過抗病毒治療達到的病毒載量降低可部分重塑NK細胞的表型和功能[1]。

免疫清除期患者不但IFNα2分泌增加而且NK細胞IFNAR2的表達上調，激活的NK細胞有利于HBV的清除。免疫耐受患者雖然NK細胞IFNAR2表達上調，但是外周血IFNα2分泌量明顯不足，不能有效的激活NK細胞，這可能是免疫耐受患者HBV長期存在的原因。而IFNα2分泌不足可能是pDC功能受損所致[11]。急性乙型肝炎患者IFNα2分泌水平和健康人相近，但我們知道急性乙型肝炎95%以上表現為自限性，因此我們推測，急性乙型肝炎HBV的清除可能依賴非IFNα2途徑。

在慢性乙型肝炎患者，激活的NK細胞在清除HBV的同時也增加肝臟的損傷[7]。我們的研究發現，免疫清除期患者ALT與HBV DNA呈負相關，因此我們認為ALT可作為評估免疫清除期患者免疫清除HBV水平的指標。在急性乙型肝炎患者我們發現ALT與HBV DNA呈正相關。我們推測，急性HBV感染時，病毒的快速擴增可能是導致肝臟損傷的機制。另外，在免疫激活時，HBV可刺激NK細胞上IFNAR2表達。

總之，NK細胞在HBV感染過程中的功能二分化明顯，雖然在清除HBV方面發揮重要作用，但是也會造成肝臟損傷，而且其激活受許多因素的影響。增強NK細胞分泌細胞因子的功能，減弱其細胞毒功能也許是以后治療HBV感染的新策略。

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Study the change of NK cells in HBV infection

QuXiaojing,LiMinghui,CaoWeihua,ZhangDan,ZhangLu,LuYao,HuLeiping,WuShuling,HuaWenhao,SongShujing,LiuShunai,XieYao,WuJiang,ChengJun

LiverCenterofBeijingDitanHospital,CapitalMedicalUniversityBeijing100015,China(QuXJ,LiMH,CaoWH,ZhangD,ZhangL,LuY,HuLP,WuSL,HuaWH,SongSJ,LiuSA,XieY,ChengJ);BeijingCenterforDiseasesControlandPrevention,Beijing100013,China(WuJ)

XieYao,Email:xieyao00120184@sina.com;LiuShunai,Email:liusa1031@sina.com

ObjectiveBackgroundNaturalkiller(NK)cellsisanimportantcomponentoflymphocytes,partoftheinnateimmunity.InhepatitisBvirus(HBV)infection,NKcellscannotonlyinhibitthereplicationofvirus,butalsocancauseliverdamage.Now,thespecificmechanismofNKcellstoclearHBVisstillcontroversial.MethodsThestudycomparedtheperipheralbloodNKcells,CD56brightsubsets,CD56dimsubsets,theexpressionofsurfacereceptorsIFNAR2andNKp46onNKcellsandthelevelofIL-10,TGF-β1,IFNα2,IFNγandtheircorrelationwithALTandHBVDNAamongthepatientsofchronicHBVinfectionimmuneclearancephase(n=49),acutehepatitisB(n=32),chronicHBVinfectionimmunetolerancephase(n=30)andhealthycontrols(n=13).ResultsWefoundthatthefrequencyofCD3-CD56+NKcellsisreducedinHCandAHB.ThefrequencyofCD56dimsubsetsplayinganimportantroleofcytotoxicityisreducedtoo.However,thefrequencyofCD56brightsubsetswhichmainlysecretesIFNγincreases.InconsistentlytheleveloftheIFNγisreducedsignificantlyintheperipheralblood.WefoundthatthereisnoobviousdifferenceofthefrequencyofCD3-CD56+NKcellsandtheirsubsetsbetweenITandHC.ThelevelofIL-10whichcaninhibitNKcellstoproduceIFNγincreasesinICandAHB,TGF-β1,anotherinhibitorycytokine,increasestoo.ThelevelofIFNα2increasesandtheexpressionofthesurfacereceptorIFNAR2onNKcellsisup-regulatedinIC.HoweverinIT,theexpressionofthesurfacereceptorIFNAR2ofNKcellsisup-regulatedbutthelevelofIFNα2isreduced.ThelevelofIFNα2inAHBandHCissimilar.ThereisapositivecorrelationinICandapositivecorrelationinAHBbetweenALTandHBVDNA.HBVDNAandtheexpressionofIFNAR2onNKcellshaveapositivecorrelationinIC.ConclusionsInICandAHB,NKcellsareinhibitedwhichmaycontributetoreducingliverdamage.AndthecytotoxicityofNKcellsisretained,butthefunctiontosecretecytokinesisdamaged.TheinsufficientsecretionofIFNα2can’tactivateNKcellseffectivelywhichmaycontributetoHBVlong-standinginIT.ItmaynotdependonIFNα2toclearHBVinAHB.ALTcanbeusedtoevaluatethelevelofclearanceHBVinIC.TherapidexpansionofthevirusmaybethemechanismofliverdamageinAHB.Inaddition,whenimmuneresponseofthehostisactivated,HBVmaystimulateNKcellstoup-regulatethesurfacereceptorIFNAR2.

HepatitisBvirus;innateimmunity;naturalkillercells;cytokines

謝堯，Email:xieyao00120184@sina.com 劉順愛，Email:liusa1031@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.006

肝炎病毒，乙型；固有免疫；自然殺傷細胞；細胞因子

國家自然科學基金(81071344)；北京市科學技術委員會重大項目(D121100003912001)

2016-06-06)