不同類型樣本對黃熱病實驗室檢測的意義

呂燕寧 李潔 盧桂蘭 杜軼威 陳麗娟 竇相峰 孫瑛 黎新宇 龐星火 王全意

100013 北京市疾病預防控制中心傳染病與地方病控制所 北京預防醫學研究中心

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·論著·

不同類型樣本對黃熱病實驗室檢測的意義

呂燕寧 李潔 盧桂蘭 杜軼威 陳麗娟 竇相峰 孫瑛 黎新宇 龐星火 王全意

100013 北京市疾病預防控制中心傳染病與地方病控制所 北京預防醫學研究中心

目的 探討不同類型的樣本對黃熱病實驗室檢測的意義。方法 采用實時熒光RT-PCR法檢測5例黃熱病病例不同時間采集的不同類型樣本中黃熱病毒的核酸。結果 5例病例中，1例患者在病程≤6 d時采集的樣本中，僅在血清中檢測到病毒核酸；另外4例患者在病程≥6 d時采集的樣本中，僅在尿液中檢測到病毒核酸。結論 黃熱病感染早期，病毒核酸檢測為快速靈敏的實驗室檢測方法，血清樣本為病毒核酸檢測的適宜臨床樣本，隨著病程的推移，尿液樣本逐漸成為病毒核酸檢測的適宜臨床樣本。

黃熱病是由黃熱病毒引起的蚊媒傳染病，是一種以發熱、黃疸、蛋白尿、相對緩脈和出血等為主要臨床特征的急性傳染病，在非洲和南美洲的熱帶地區呈地方性流行。有33個國家約4．5億人處在黃熱病感染危險中[1]，據世界衛生組織(WHO)估計，現在每年全球約有20萬黃熱病病例，死亡6萬例，病死率高達20%-50%，嚴重威脅人類健康。隨著全球經濟發展，國際間人際交往的頻繁，使黃熱病的傳播加速，其疫區不斷擴大，黃熱病疫情進入非黃熱病流行區的風險日益增加，不僅成為地區性的嚴重公共衛生問題，而且也是全球性的嚴重威脅。黃熱病是WHO，也是我國《國境衛生檢疫法》規定的國境衛生檢疫三大傳染病之一。因此，及時發現病例對預防和控制該病的傳播和流行具有重要意義。

本研究報道了北京市5例輸入性黃熱病病例不同時間、不同類型的樣本的實驗室檢測過程與結果，探討不同時間、不同類型樣本的檢測意義，對提高該類病例的檢測能力、及時發現可疑病例、防止該病傳入我國具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 患者樣本 2016年3月11日至2016年4月11日，共收集北京市5例黃熱病輸入病例的臨床樣本(表1)，包括非抗凝全血、唾液、咽拭子、尿液等，于4 ℃條件下運輸至北京市疾病預防控制中心實驗室進行檢測。

1.2 樣本處理與保存 實驗室收到全血樣本后，4 ℃、4 000rpm、5min離心分離血清，將血清進行分裝，唾液、咽拭子和尿液也進行分裝，除了即時用于實驗室檢測的樣本外，均于-80 ℃保存。

1.3 核酸提取 血清、唾液、尿液與咽拭子樣本均取140μl，采用Qiagen公司生產的試劑盒QIAampViralRNAKit(52906)提取病毒RNA。

1.4 實時熒光RT-PCR檢測 黃熱病毒核酸檢測采用生科源技術有限公司生產的試劑盒(SKY-8612)。儀器采用LightCycler480II實時熒光PCR儀，反應條件及結果判斷參照試劑盒說明書進行。結果以LightCycler480II軟件(版本1.5.0)分析。樣本結果判定：陽性樣本檢測結果Ct值≤30，有明顯指數增長；可疑樣本檢測結果Ct值在30-35范圍，此時應對樣本進行重復檢測，如果重復實驗結果Ct值仍在30-35范圍，有明顯指數增長，則判定為陽性，否則為陰性。陰性樣本檢測結果Ct值>35或無Ct值。

表1 5例病例的基本信息及不同樣本的檢測結果

1.5 測序 將陽性擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行克隆測序。序列通過NCBI的BLAST進行DNA序列比對。

2 結果

2.1 病例基本信息和不同病程、不同類型樣本的檢測結果 5例病例采樣時間距發病時間最長者為13天，最短為2天。除第一例病例在血清中檢測到病毒核酸外，其余4例病例均只在尿液中檢測到黃熱病毒核酸，其中第5例病例曾于11個月前接種過黃熱病疫苗(表1)。

注：Gambia 2001-AY572535.1為黃熱病毒Gambia 2001株(GenBank: AY572535.1)，以此類推，每個序列以毒株名稱及其GenBank收錄號命名， positive control為本實驗所用試劑盒中陽性對照的擴增產物序列，BJYF01-BJYF05為本研究中5個病例樣本中的黃熱病毒序列。圖1 5例病例樣本擴增序列進化樹分析Note: Grambia 2001-AY572535.1 is yellow fever virus Grambia 2001 Strain(GenBank:AY572535.1).Equally, every sequence was named as strain name and its Genbank No., positive control is the sequence of positive control in the kit. BJYF01-BJYF05 are sequences from 5 cases in this studyFig.1 Phylogenotic tree analysis of the amplified sequences from 5 cases’ samples

2.2 5例病例擴增產物的序列測定與比對結果 將5例病例的擴增產物進行克隆測序，得到88個堿基的序列，在NCBI網站進行BLAST，結果顯示5例病例擴增產物的序列均與黃熱病毒Angola71株相匹配，相似度為95%。而試劑盒的陽性對照擴增產物為86 bp的核酸片段，序列與黃熱病毒疫苗株17D、17D-204、17D/Tiantan、YF/Vaccine/USA/Sanofi-Pasteur-17D-204/UF795AA/YFVax等相匹配，相似度為100%。擴增序列進化樹分析見圖1。

3 討論

黃熱病是由黃熱病毒引起經埃及伊蚊、南美洲Haemogogus蚊和少數伊蚊屬蚊種等傳播的一種病死率高、危害性較大的傳染病。人對該病毒普遍敏感，不分年齡、性別和種族。本病一般呈散發，如果媒介蚊蟲大量繁殖，感染能在人群中引起暴發流行，危害極大。我國不是黃熱病的流行區，既往也從未發現黃熱病的傳入，隨著我國改革開放以及對外交流的增多，自2016年3月起我國陸續從非洲黃熱病流行區安哥拉經多個口岸輸入了多起黃熱病病例，因此，黃熱病的檢疫和快速敏感的實驗室檢測對嚴防病例輸入顯得至關重要。

黃熱病的實驗室檢測方法主要有病毒分離、血清特異性IgM/IgG抗體檢測、病毒抗原以及黃熱病毒RNA檢測等，疑似病例的任一實驗室檢測結果陽性均可以確診[2,3]。而常規的黃熱病毒培養對實驗室的要求較高，需要在生物安全三級實驗室(BSL-3)內進行，且操作復雜、費時?？乖瓩z測的靈敏度不高，抗體檢測與其他黃病毒有明顯的交叉反應，這給血清學診斷帶來了一定的困難。PCR方法以其快速、靈敏、特異性強等優點在黃病毒屬病毒的快速檢測和鑒別方面有著廣泛的應用[4]。

由于國內之前從未有過黃熱病確診病例的出現，因此對于此類病例的病毒核酸檢測樣本的采集時機以及需要采集的樣本類型缺乏了解。有資料推薦采集全血、血清、腦脊液、腹腔液或胸腔液以及肝組織活檢等[5]，但各種樣本采集的難易程度、患者的可接受程度以及檢測的敏感性均不同，對于診斷的意義也不同。如何在最佳時機采集最佳樣本是關系到能否對病例進行迅速準確的診斷，并將對患者的損害降到最低。對此查閱國內外文獻鮮有論述，僅有的研究報道為接種黃熱病疫苗后，健康者和出現疫苗相關副反應者尿液中能夠檢測到疫苗株病毒核酸，可持續到20多天，甚至可達198 d[5，6]。國內外關于同屬病毒，如登革和寨卡病毒的適宜檢測樣本類型研究較多，研究發現這些病毒感染后可在患者唾液、尿液中檢測到病毒核酸[7-12]，但對于黃熱病未能查到相關的研究和報道。

我國往從未有本地或輸入性黃熱病病例的報道[13]。隨著我國與非洲、南美等黃熱病流行區交流的增多，北京市于2016年3月11日發現中國首例黃熱病輸入病例[14-16]，截至4月11日一個月的時間內又陸續發現4例輸入病例。我們對這有限的5例病例嘗試采集了不同類型的樣本，觀察了在不同病程時間、不同樣本對黃熱病毒核酸檢測的意義。由于首例患者入院后即出現了嚴重的腎功能衰竭，采取了透析治療，未能及時采集到患者的尿液樣本，其余患者均采集到了血液、唾液和尿液樣本。

由于樣本量有限以及現有試劑的局限性，不能對所有樣本進行多次重復檢測，僅在初次檢測時進行了重復實驗，也不能對樣本中病毒核酸的拷貝數進行精確定量，僅能根據Ct值來進行評估和討論。因此本次研究采取了嚴格的實驗室質控，每次核酸提取均采用相同的樣本量、相同的提取流程，并設提取對照。每次實時熒光RT-PCR反應均設陰性及陽性對照。每個病例同次采集的樣本均作了重復實驗。將不同時間采集的不同樣本采用相同的實驗過程和條件進行檢測，盡量去除其他因素的影響以保證實驗結果的可比性。檢測陽性的樣本均采用二代測序技術進行了序列測定，并獲得了病毒的全基因組序列(結果尚未發表)。

研究結果顯示，不同時間采集的血清樣本中，病毒核酸量隨病程進展而降低。黃熱病典型臨床過程可分為病毒血癥期、緩解期、肝腎損傷期和恢復期。其中病毒血癥期可持續3-5 d，可以在患者血液中檢測到病毒核酸。在我們觀察的5例病例中，只有首例病例由于病情較重，并最終在發病9 d時死亡，因此病毒血癥期持續存在，在發病6 d時采集的樣本中仍然可以檢測到病毒核酸。其他病例在病程≥6 d時采集的血清樣本中均未檢測到病毒核酸。

不同類型樣本中，5例患者有4例采集到唾液樣本，除首例病例唾液樣本病毒核酸檢測值處于灰區外，其他3例患者的唾液檢測均為陰性，因此從這幾例病例的檢測實踐來看，唾液并不適合作為黃熱病急性期的指示樣本來采集。5例病例中，有2例采集了咽拭子，但也均未檢出病毒核酸。5例病例中有4例采集到了尿液樣本，病毒核酸檢測均為陽性，這4例患者的病程≥6 d，血清檢測均為陰性。

綜合上述結果，血清和尿液可作為黃熱病毒核酸檢測的有效樣本。血清適宜在發病早期采集，發病超過5-6 d后尿液的檢測對病例診斷更有意義。而唾液樣本的檢測敏感性很低，不適宜采用。

擴增產物的序列測定與比對顯示5例病例樣本擴增子的序列均與黃熱病毒Angola71株的序列相匹配，而試劑盒陽性對照擴增子序列則與黃熱病毒的17D、17D-204、17D/Tiantan等多種疫苗株的序列100%匹配，因此我們目前采用的試劑盒不能區分黃熱病疫苗株和野毒株Angola71，而Angola71是目前疫區的流行株。由于部分人群接種黃熱疫苗后會出現不良反應[17]，而且接種者尿液中能夠檢測到疫苗株病毒核酸[6]，因此，對于近期由安哥拉疫區輸入的疑似病例，采用本試劑盒進行檢測時一定要詢問患者的疫苗接種史，了解其是否接種了疫苗、接種了多長時間等，以便對實驗結果做出正確解釋和判斷，必要時要采用測序方法進行確證。本研究中的第5例患者，在11個月前接種過黃熱病疫苗，但測序結果顯示此次發病是由于感染了疫區的野毒株所致。

[1] 鄧掌，張海林. 黃病毒及其相關疾病研究進展[J]. 國際病毒學雜志, 2009, 16(6): 161-167. doi: 10.3760/cma.j.issn.1673-4092.2009.06.001.

[2] 《黃熱病診療方案(2016年版)》國衛辦醫函〔2016〕323號 [EB/OL]. http://www.nhfpc.gov.cn/yzygj/s3593g/201604/9940aa0e0bee4e5eaaac03a21d18e7e9.shtml.

[3] 《黃熱病防控方案(2016年版)》國衛辦疾控函〔2016〕382號 [EB/OL]. http://www.nhfpc.gov.cn/jkj/s3577/201604/328d68d317d647e086c4b0000d2507da.shtml.

[4] Lanciotti RS. Molecular amplification assays for the detection of flaviviruses [J]. Adv Virus Res, 2003, 61: 67-99. doi: http://dx.doi.org/10.1016/S0065-3527(03)61002-X.

[5] Domingo C, Yactayo S, Agbenu E, et al. Detection of yellow fever 17D genome in urine [J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(2): 760-762. doi:10.1128/JCM.01775-10.

[6] Martinez MJ, Vilella A, Pumarola T, et al. Persistence of yellow fever vaccine RNA in urine[J]. Vaccine, 2011, 29(18): 3374-3376. doi:10.1016/j.vaccine.2011.02.075.

[7] Andries AC, Duong V, Ly S, et al. Value of Routine Dengue Diagnostic Tests in Urine and Saliva Specimens [J]. PLoS Negl Trop Dis, 2015, 9(9): e0004100. doi:10.1371/journal.pntd.0004100.[8] Poloni TR, Oliveira AS, Alfonso HL, et al. Detection of dengue virus in saliva and urine by real time RT-PCR [J]. Virol J, 2010, 7(1): 1-22. doi:10.1186/1743-422X-7-22.

[9] Musso D, Roche C, Nhan TX, et al. Detection of Zika virus in saliva [J]. J Clin Virol, 2015, 68(7): 53-55. doi: 10.1016/j.jcv.2015.04.021.

[10] Gourinat AC, O′connor O, Calvez E, et al. Detection of Zika virus in urine. Emerg Infect Dis, 2015, 21(1): 84-86. doi: http://dx.doi.org/10.3201/eid2101.140894.

[11] 王悅涵，呂燕寧.寨卡病毒與寨卡病毒病研究進展[J]. 國際病毒學雜志, 2016, 23(2):141-144. doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4092.2016.02.021.

[12] 鄭陽，王全意. 寨卡病毒病研究現況及疫情形勢[J]. 國際病毒學雜志, 2016, 23(2):73-75. doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4092.2016.02.001.

[13] 古麗努爾5買買提，雷霞，趙燕，等. 黃熱病現情分析與衛生檢疫工作的研究進展[J]. 口岸衛生控制, 2014, 19(3): 41-43.doi: 10.3969/j.issn.1008-5777.2014.03.012.

[14] 呂燕寧，李潔，陳麗娟，等. 中國首例黃熱病輸入病例的實驗室檢測[J]. 首都公共衛生, 2016, 10(2): 61-63. doi: 10.16760/j.cnki.sdggws.2016.02.004.

[15] 竇相峰，鄭陽，呂燕寧，等. 中國首例輸入性黃熱病病例的流行病學調查[J]. 中華流行病學雜志, 2016, 37(6): 788-790. doi: 10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2016.06.009.

[16] 竇相峰，田麗麗，呂燕寧，等. 中國首次輸入性黃熱病疫情處置及相關問題探討[J]. 國際病毒病學雜志, 2016, 23(4): 217-219. doi:10.3760/cma.j.issn.1673-4092.2016.04.001.

[17] 王魯平. 黃熱病減毒活疫苗(17D)的不良反應[J]. 藥物不良反應雜志, 2003, 5(4): 245-247. doi: 10.3969/j.issn.1008-5734.2003.04.009.

Significance of different types of samples for the laboratory detection of yellow fever

LyuYanning,LiJie,LuGuilan,DuYiwei,ChenLijuan,DouXiangfeng,SunYing,LiXinyu,PangXinghuo,WangQuanyi

InstituteofInfectiousandEndemicDiseasesControl,BeijingCenterforDiseasesControlandPrevention,BeijingCenterforPreventiveMedicine,Beijing100013,China

WangQuanyi,Email:bjcdcxm@126.com

ObjectiveToinvestigatethesignificanceofdifferenttypesamplesforthelaboratorydetectionofyellowfever.MethodsDifferenttypesofsampleswerecollectedatdifferenttimefrom5yellowfevercases,andtheyellowfevervirusRNAwasdetectedbyreal-timePCR.ResultsForthe5casesamongthesamplescollectedin≥6daysfromtheonset,onlytheserumsamplefrom1patientwaspositiveandtheurinesamplesfromtheother4patientswerepositive.ConclusionsIntheearlyphaseofyellowfever,theviralRNAdetectionisafastandsensitivelaboratorytestmethod,andserumistheappropriateclinicsamplefortheviralRNAdetection.Withthelapseoftime,urinebecomestheappropriateclinicsamplefortheviralRNAdetection.

Yellowfever；Laboratorydetection；ViralRNA；Sample

王全意，Email: bjcdcxm@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.007

黃熱??；實驗室檢測；病毒核酸；樣本

2016-06-04)