紅景天對缺血心肌腎上腺髓質素表達的靶向作用

阿力木江·買買提江 李 勇 施海明 姜曉斐

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紅景天對缺血心肌腎上腺髓質素表達的靶向作用

阿力木江·買買提江 李 勇 施海明 姜曉斐

目的：探討紅景天對大鼠心肌梗死后血管新生過程中腎上腺髓質素(adrenomedullin, ADM)表達的調控作用。 方法：將8周齡雄性Wistar大鼠分為4組，正常對照組、假手術組、心肌梗死造模后生理鹽水對照組(生理鹽水組)及心肌梗死造模后紅景天干預組(紅景天組)。飼養1周后處死動物，摘取心臟制作石蠟切片，采用CD31免疫組化染色進行微血管標記染色；處死動物前留取血漿，采用ELISA法測定血漿ADM濃度；Western blot檢測不同組心肌組織ADM的蛋白表達水平。 結果：與正常對照組、假手術組及生理鹽水組相比，紅景天組大鼠心肌梗死邊緣區微血管密度明顯升高；紅景天組(1.06±0.01)及生理鹽水組(0.52±0.09)的缺血心肌組織ADM蛋白表達水平較正常對照組及假手術組均明顯升高(P<0.05)，紅景天組較生理鹽水組ADM蛋白表達水平進一步升高(P<0.05)；紅景天組[(32.28±5.13)ng/L]和生理鹽水組[(28.55±3.49) ng/L]血漿ADM水平較正常對照組及假手術組均明顯升高(P<0.05)，但紅景天組和生理鹽水組之間無明顯差異。 結論：心肌梗死后大鼠血漿ADM水平變化與心肌內不同步，紅景天對ADM表達的上調作用主要在缺血心肌，具有一定的靶向性。

紅景天；腎上腺髓質素；心肌梗死；血管新生

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)是指通過藥物、轉基因或其他干預手段，加快缺血心肌新生血管的形成[1]。體內血管新生過程是由血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、腎上腺髓質素(ADM)等多種促血管新生因子調控的。

ADM是一種心血管活性多肽,具有擴血管、抑制血管平滑肌細胞增殖等多種生物學效應[2]。目前研究發現ADM在心力衰竭[3]、心肌梗死[4]及肺動脈高壓[5]等多種心血管疾病中具有明顯的保護作用，這與其改善內皮細胞功能、舒張血管、抑制細胞凋亡及促進血管新生等多種保護性機制相關[6-8]。

紅景天是生長于高寒低氧地帶的植物，其耐缺氧作用的機制一直受到關注。紅景天的藥理作用廣泛[9-10]，我們以往的研究證實紅景天具有促缺血心肌血管新生的作用[11-13]，本研究初步探討紅景天對缺血心肌ADM表達的靶向作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

8周齡雄性Wistar大鼠24只(由復旦大學實驗動物中心提供)隨機分為4組：正常對照組3只，不進行任何干預；假手術組3只，開胸后僅在相應手術部位空穿1針后關閉胸腔,前兩組動物只進行普通喂養；其余兩組為心肌梗死造模組，根據干預藥物分為生理鹽水組和紅景天組，每組9只。采用冠狀動脈結扎標準方法建立急性心肌梗死大鼠模型[14],造模前7 d開始藥物干預，每日清晨灌胃1次，每次2 mL干預藥物，至造模后7 d，經股動脈采血5 mL，留存血漿后處死大鼠，取出心臟進行相關檢驗。

1.2 干預藥物制備

大花紅景天(上海雷允上大藥房)塊莖粉碎后水煎3次，藥汁過濾濃縮干燥后制成干粉(1 kg紅景天塊莖制成紅景天干粉211.59 g)，高效液相色譜-紫外檢測法測定每克紅景天干粉中含8.3 mg紅景天苷。18 g紅景天干粉溶解于300 mL蒸餾水中制備紅景天溶液。

1.3 組織化學檢測

大鼠心肌組織常規脫水石蠟包埋切片(厚度4 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察心肌細胞形態學特征；CD31免疫組化染色(SP法)進行微血管標記染色?！?00視野下觀察微血管密度。

1.4 ELISA檢測血漿ADM濃度

大鼠處死前留取的血漿按照ADM酶聯免疫試劑盒(上海源葉生物技術有限公司)標準步驟操作，450 nm波長測量吸光度(OD值)，繪制標準曲線并計算血漿ADM濃度。

1.5 Western blot檢測心肌ADM表達

用含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液抽提組織蛋白，BCA法繪制標準曲線定量蛋白濃度并稀釋配平。SDS-PAGE電泳法(10%分離膠、4%濃縮膠)分離蛋白并轉移到PVDF膜，ADM抗體(1∶500,RD公司)、 β-actin(1∶2000，RD公司)抗體4℃過夜，二抗室溫孵育1 h后顯影。

1.6 統計學分析

采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅景天促缺血心肌血管新生

大鼠心肌梗死造模7 d后對心臟組織切片行HE染色，與假手術組相比，紅景天組及生理鹽水組光鏡下可見梗死邊緣區心肌凝固性壞死，間質水腫及中性粒細胞浸潤明顯，但紅景天組和生理鹽水組非梗死區鏡下表現與正常對照組和假手術組相似，均未見明顯異常，見圖1。

CD31免疫組化染色后紅景天與生理鹽水兩組梗死邊緣區與非梗死區相比，梗死邊緣區CD31染色陽性的棕褐色細胞(心肌微血管內皮細胞)較多；與生理鹽水組相比，紅景天組梗死邊緣區棕褐色染色較密集，形成管腔較多；紅景天和生理鹽水組非梗死區與正常對照組及假手術組相似。見圖2。

注：A為紅景天組梗死邊緣區；B為生理鹽水組梗死邊緣區；C為假手術組；D為紅景天組非梗死區；E為生理鹽水組非梗死區；F為正常對照組圖1 各組大鼠心肌HE染色照片(×200)

注：A為紅景天組梗死邊緣區；B為生理鹽水組梗死邊緣區；C為假手術組；D為紅景天組非梗死區；E為生理鹽水組非梗死區；F為正常對照組圖2 各組大鼠心肌CD31免疫組化染色照片(×200)

2.2 紅景天促缺血心肌ADM蛋白表達

Western blot檢測心肌組織ADM蛋白表達水平，結果發現紅景天組和生理鹽水組ADM表達水平較正常對照組和假手術組顯著增加(P<0.05)，其中紅景天組較生理鹽水組ADM表達水平又有明顯增加(P<0.05)，見表1。

2.3 紅景天對心肌缺血大鼠血漿ADM水平無明顯影響

表1 各組大鼠心肌ADM 蛋白表達水平

注：各組數據經K-S檢驗符合正態分布。與生理鹽水組相比，(1)P<0.05；與假手術組相比，(2)P<0.05；與正常對照組相比，(3)P<0.05

采用ELISA法檢測大鼠血漿ADM濃度發現，紅景天組和生理鹽水組大鼠血漿ADM水平較正常對照組和假手術組均有升高，且差異有統計學意義(P<0.05)，但紅景天組與生理鹽水組之間血漿ADM水平無明顯差異，見表2。

表2 各組大鼠血漿ADM 水平/ng·L-1

注：各組數據經K-S檢驗符合正態分布。與生理鹽水組相比，(1)P<0.05；與假手術組相比，(2)P<0.05；與正常對照組相比，(3)P<0.05

3 討論

ADM是1993年由Kitamura等[15]在嗜鉻細胞瘤中提取的一種具有強降壓和擴血管作用的肽類物質，屬于降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide ，CGRP)超家族成員。ADM廣泛分布于心血管、呼吸道、腎臟、內分泌、生殖系統、腸道和免疫系統[16]，如此廣泛的分布提示ADM在細胞功能調節中作用的多樣性，循環中的ADM主要來源于血管內皮細胞。正常人循環中ADM水平很低，在發生心力衰竭、肺動脈高壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等多種疾病時，血漿ADM水平明顯升高[3-5]。

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物，以往研究提示在急性心肌缺血過程中，紅景天通過調節VEGF、FGF等血管新生相關因子的表達水平，促進血管新生[13]。本研究通過CD31特異性內皮細胞標記進一步證實紅景天有促缺血心肌血管新生作用，這一過程同時伴隨大鼠缺血心肌ADM蛋白表達的明顯升高。本研究還發現心肌梗死大鼠血漿ADM水平明顯高于假手術組，但與生理鹽水對照組相比，紅景天處理不影響血漿ADM水平，提示心肌缺血本身促進循環ADM的產生，但紅景天對ADM的作用定位于缺血心肌本身而非全身系統性影響。鑒于ADM為促血管新生調控因子之一，本研究提示紅景天促缺血心肌血管新生的作用可能與靶向調控心肌局部ADM水平相關。

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(收稿：2016-04-01 修回：2016-06-25)

(本文編輯：丁媛媛)

The targeting effect of rhodiola on the expression of adrenomedullin in ischemic myocardium

ALIMUJIANGMaimaitijiang,LIYong,SHIHaiming,JIANGXiaofei.

DepartmentofCardiology,HuashanHospitalaffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China

Objective:To explore the regulative effect of rhodiola on the expression of adrenomedullin(ADM) during angiogenesis of rats after myocardial infarction. Methods:The eight-week-old Wistar rats were divided into the normal control group, the sham-operated group, the saline group and the rhodiola group. They were sacrificed after one week feeding. Their hearts were resected and embedded in paraffin to make sections. Microvessels were marked with CD31 immunohistochemical staining. Plasma concentration of ADM was tested by ELISA before sacrifice. The protein expression levels of ADM in myocardial tissue among different groups were observed and compared by western blot. Results:The rhodiola enhanced the rat's microvascular density in infarcted border zones after treatment, showing significant difference as compared with saline group, sham-operated group and normal control group. The protein expressions of ADM in ischemic myocardial tissue after rhodiola (1.06±0.10) and saline treatment (0.52±0.09) were significantly higher than the other two groups (P<0.05), while rhodiola further up-regulated the ADM expression than saline (P<0.05). Plasma concentrations of ADM in rhodiola group [(32.28±5.13) ng/L] and saline group [(28.55±3.49) ng/L] were higher than those in the other two groups (P<0.05), while no significant difference was observed between rhodiola group and saline group. Conclusion:The rhodiola can up-regulate ADM expression in ischemic myocardial tissue. The change in ADM plasma concentration doesn't synchronize with the altered ADM expression in myocardial tissue after myocardial infarction. The up-regulatory effect of rhodiola on ADM expression is mainly focused on the ischemic myocardial, showing a targeting characteristic.

Rhodiola； Adrenomedullin； Myocardial infarction； Angiogenesis

國家自然科學基金(81573710)

200040 復旦大學附屬華山醫院心內科

姜曉斐，Email：sule_jiang@126.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.05.010