紅花生育酚環化酶基因的克隆及表達分析

官麗莉+崔琪+韓雨彤+武云云+胡人閣+顧天瑤+李海燕+李校堃

[摘要]生育酚環化酶（tocopherol cyclase， TC）是植物Vit E生物合成途徑的關鍵酶之一。該研究根據紅花轉錄組數據，利用RT-PCR（reverse transcription-PCR）方法從藥用植物紅花種子中克隆得到生育酚環化酶基因序列，命名為CtTC， 對其進行生物信息學分析，結果表明該基因開放閱讀框（ORF）為1 524 bp，編碼507個氨基酸，相對分子質量為62.9 kDa，等電點（theoretical pI）為5.01?？缒そY構分析表明TC存在跨膜結構。蛋白糖基化位點分析表明TC蛋白含有1個絲氨酸糖基化位點以及1個蘇氨酸糖基化位點。亞細胞定位表明其定位于葉綠體中。利用熒光定量PCR檢測紅花不同發育時期種子以及干旱脅迫不同時間的紅花葉片中TC基因的表達量，結果表明TC基因在紅花的開花后50 d的種子中表達量最高，干旱脅迫6 d時TC基因的表達量達到最高值，隨后下降，為TC基因在紅花Vit E合成以及抵抗逆境脅迫中的功能研究奠定基礎。

[關鍵詞]紅花；生育酚環化酶；克??；表達分析

[Abstract]The tocopherol cyclase was one of the key enzymes in plant vitamin E biosynthesis pathway. According to the study of Carthamus tinctorius transcriptome data，the Tocopherol cyclase gene was obtained using RT-PCR techniques and named CtTC . Bioinformatics analysis showed theopen reading frame （ORF）of CtTC was 1 524 bp. The putative protein contained 507 amino acids with a predicted molecular mass of 62.9 kDa and theoretically isoelectric point was 5.01.Signal peptide analysis showed that it was a non secretory protein， and there was no signal peptide. The subcellular localization showed that the CtTC protein was located in the chloroplast. The expression of CtTC gene in safflower seeds at different development stages was determined by quantitative real-time PCR， it was found that the highest expression level of CtTC gene was detected in 50 DAF.Quantitative RT-PCR analysis suggested that expression of CtTC is induced and strengthened by drought stresses. This research provided a candidate gene for metabolic engineering of vitamin E and resisting stress.

[Key words]Carthamus tinctorius； tocopherol cyclase； clone； expression analysis

doi：10.4268/cjcmm20162005

紅花Carthamus tinctorius L， 又稱草紅花或刺紅花， 為一年生或兩年生菊科植物^[1]， 在中國大部分地方均有栽培， 主要分布于河南、 四川、 新疆、 浙江等地。紅花籽，又稱“白平子”，是傳統中藥紅花的種子，李時珍在《本草綱目》中稱其“功能與花同”^[2]。紅花籽中富含Vit E、不飽和脂肪酸等，被廣泛應用于食品、保健品等領域。

紅花中有效成分有黃酮類物質、不飽和脂肪酸、Vit E等，紅花有效成分種類以及藥理作用的研究已有大量報道^[3-4]。近年來，隨著新一代測序技術的廣泛應用，人們從基因組、轉錄組角度對紅花進行研究。劉秀明等^[5]應用454測序技術對紅花C. tinctorius初花期和盛花期2個樣本進行轉錄組測序， 獲得黃酮合成途徑的關鍵酶基因包括查爾酮合酶（chalcone synthase， CHS；EC2.3.1.74）、查爾酮異構酶（chalcone isomerase， CHI；EC 5.5.1.6）和花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS；EC 1.14.11.19）。Li等^[6]以紅花種子、花瓣、葉片為材料，進行了轉錄組分析，共注釋了153 769條 unigene其中23 條unigene參與黃酮類化合物的合成8條unigene參與油體蛋白的合成。本課題組前期從紅花C. tinctorius中克隆到一個紅花Vit E 合成相關關鍵酶 2-甲基-6-葉綠基-1，4-苯醌甲基轉移酶（MPBQ MT）基因^[7]。

Vit E又名“生育酚”（tocopherol），是植物和光合微生物合成的一類脂溶性維生素，在人類和動物的日常膳食中起著不可或缺的作用Vit E包括生育酚和生育三烯酚2類共8種化合物，即α，β，γ，δ-生育酚（tocopherol）和α，β，γ，δ-生育三烯酚（tocotrinol），具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、預防心血管疾病、提高免疫力等多種功能^[7]。獲取Vit E所需的油料作物種子中雖然Vit E含量較多，但提取困難成本很大，市場上對天然Vit E的需求越來越大，并且植物的種子中主要的Vit E成分是δ-生育酚，但δ-生育酚生物活性很低，且不易于被人體吸收；生物活性高的Vit E成分為α-生育酚和γ-生育酚。因此，利用基因工程的方法提高作物中Vit E的含量，改進天然Vit E提取方法，成為目前植物Vit E代謝研究的熱點。隨著生物合成關鍵酶基因的克隆，生物工程已經成為提高植物Vit E含量的有效途徑。生育酚環化酶（tocopherol cyclase，TC）是生育酚合成途徑中的倒數第2個酶，它可以以MPBQ，DMPBQ為底物，分別生成易被人體吸收的α-生育酚和γ-生育酚；也可以以MGGBQ，DMGGBQ為底物^[8]，分別生成α-生育三烯酚和γ-生育三烯酚，是Vit E生物合成下游的關鍵酶之一。目前，TC的cDNA序列已在擬南芥Arobidopsis thalina L.、油菜Brassica campestris L.、大豆Glycine max等多種植物中得到克隆^[9-15]。因此，TC基因的表達及活性對決定植物Vit E的組成起著重要作用，對培育高γ-生育酚和α-生育酚的新品系具有重要的指導意義。

本研究以紅花種子為材料，利用課題組前期轉錄組測序文庫中高表達的Uingene700為基礎^[6]，利用RT-PCR技術克隆紅花CtTC基因的cDNA序列，并對其序列進行生物信息學分析及表達分析，為人們深入了解TC基因在植物Vit E代謝途徑的表達調控研究奠定基礎。

1 材料

1.1 樣品 紅花C. tinctorius樣品采自吉林農業大學種植基地，由吉林農業大學胡全德教授進行物種鑒定。取開花后5，15，30，50 d的新鮮種子用于表達分析，用開花后50 d種子（成熟種子）用于TC基因克隆。剪取花苞，取新鮮種子，迅速放于液氮中，錫箔紙包好后于-80 ℃保存備用。15% PEG 8000模擬干旱條件，對四葉期紅花進行干旱脅迫，分別取脅迫0，2，4，6，8，10 d后的葉片，迅速放于液氮中，錫箔紙包好后于-80 ℃保存備用。

1.2 儀器與試劑 限制性內切酶、RNAiso Plus試劑、LA Taq 酶、高純質粒小量制備試劑盒、 DNA 連接試劑盒、 DNA 純化回收試劑盒、反轉錄試劑盒、 SYBR@Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus）均購自寶生物工程（大連）有限公司，pEASY-T1載體、DH5α感受態細胞（Trans-T1）購自北京全式金生物技術有限公司。其他常規試劑均為國產或進口分析純級。

2 方法

2.1 轉錄組數據分析 根據紅花種子轉錄組數據分析結果，依據基因注釋尋找TC基因對應的2個unigene（Unigene700l和Unigene54146）。通過NCBI ORF Finder在線預測，發現Unigene700_All對應的序列具有完整的開放閱讀框。

2.2 RNA提取和cDNA合成 取紅花各組織置于液氮中研碎，總RNA提取方法按照RNAiso Plus試劑說明書進行，提取后進行純度及濃度測定；并于-80 ℃保存備用。cDNA合成根據寶生物工程（大連）有限公司反轉錄試劑盒操作進行，反轉錄產物分離純化后置于-20 ℃保存備用。

2.3 紅花TC基因的克隆 根據具有完整ORF的TC基因序列設計引物TC-F和TC-R。以反轉錄后的cDNA為模板進行TC基因ORF克隆。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃終止反應。獲得目的基因的全長cDNA。對PCR產物進行回收，連接pEASY-T1 Vector，并轉化DH5α感受態細胞，通過藍白斑篩選后，挑取白色菌落過夜培養，提取質粒，PCR、雙酶切鑒定重組子，然后測序（由上海生工生物工程公司完成）。

2.4 生物信息學分析 ORF Finder在線軟件MPBQ MT基因cDNA的開放閱讀框（ORF）與相應的氨基酸序列。將獲得TC基因全長序列通過BLAST搜索NCBI的蛋白質和核苷酸數據庫，并通過DNAMAN軟件翻譯成氨基酸序列，利用DNAMAN軟件對來源于各種植物的生育酚環化酶（tocopherol cyclase， TC）的相關氨基酸序列進行同源比對。使用ChloroP服務器v1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/ChloroP）進行葉綠體轉運肽預測。相對分子質量與理論等電點（pI）預測采用ExPASy 在線服務器的Compute Pi/Mw 工具，二級結構預測使用 Dublin 大學的Porter 服務器，結構功能域分析采用ExPASy在線務器Prosite Scanprosite。

2.5 紅花CtTC基因表達分析 提取開花后5，15，30，50 d的新鮮種子及干旱處理的紅花葉片的RNA，并反轉錄為cDNA用于Real-time PCR分析。定量PCR反應體系為：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL；上下游引物（表1）各0.4 μL；ROX Reference Dye Ⅱ（50×）；DNA模板2 μL；ddH₂O 6.8 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 變性5 s， 60 ℃退火30 s， 40個循環。

3 結果分析

3.1 RNA提取 對不同發育時期的紅花種子的總RNA進行濃度和純度檢測，得到的RNA質量濃度分別為150～210 mg·L^-1，A₂₆₀ /A₂₈₀的比值為1.8～2.0，表明所提取的總RNA 完整性和純度較好，可用于下一步實驗（圖1）。

3.2 紅花TC基因的克隆 根據CtTC基因編碼區序列特異引物（TC-F，TC-R），以紅花種子cDNA為模板擴增出一條1 524 bp的條帶（圖2A）。經回收

純化后，PCR 產物與pEASY-T1載體連接， 通過菌液PCR驗證（圖2B） 和質粒的SpeⅠ和EcoRⅤ雙酶切驗證（圖2C），測序結果正確，命名該基因為CtTC （Genbank登陸號 KX501215）。

3.3 CtTC蛋白理化性質分析 TC基因ORF長1 524 bp，利用 ExPASy Proteomics Server的在線軟件 Protparam預測 CtTC編碼蛋白的理化性質。CtTC蛋白包含507個氨基酸， 分子式為C₄₆₀₆H₇₆₉₀N₁₅₂₄O₁₉₄₄S₂₉₈，總原子數為16 062。相對分子質量為62.905 kDa；理論等電點pI 5.01，帶正電殘基（Arg+Lys）為0，帶負電殘基 （Asp+Glu）為0。該蛋白的不穩定系數為43.08，表明CtTC編碼蛋白不穩定。

3.4 CtTC蛋白二級結構、跨膜區、亞細胞定位、糖基化位點預測分析 采用SWISS-MODEL（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl） SOPMA 進行CtTC基因的編碼蛋白二級結構分析和結構域預測（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）。CtTC的編碼蛋白二級結構中α-螺旋 （alpha helix） 占20.9%、延伸鏈 （extended strand）占24.26%、β-折疊（beta turn）占14.4%、無規卷曲 （random coil）占40.43%（圖3）。

跨膜螺旋分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）表明該蛋白為膜外蛋白。在線工具WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org/）預測該蛋白的亞細胞定位情況如下：chlo：8.0， cyto：3.0， nucl：2.0；表明該蛋白可能定位于葉綠體。使用ChloroP在線軟件對葉綠體轉運肽進行預測，結果表明CtTC蛋白含有葉綠體轉運肽，為第1～57個氨基酸，推測該蛋白合成后運送到葉綠體并在此行使功能。

3.5 CtTC蛋白同源性及系統進化樹分析 利用DNAMAN軟件，將紅花TC蛋白與Genbank中已公布的白梨（XP 009367482.1）、蘋果（XP 008393882.1）、野草莓（XP 0094291189.1）、大豆（XP 003526485.1）、苜蓿（XP 013462012.1）、荷花（XP 010254049.1）、胡桃（AHH29648.1）、巨桉（XP 010049096.1）、古尼桉（AAP97931.1）、麻瘋樹（XP 012077416.1）、可可（XP 007012099.1）、木本棉（XP

KHF98490.1）、陸地棉（XP 012436528.1）、向日葵（ABB52812.1）、生菜（ADC91914.1）、芝麻（NP 001291340.1）、煙草（AIC85301.1）、林煙草（XP 009770568.1）的TC氨基酸序列進行同源比對，結果發現克隆到的紅花TC基因與生菜Lactuca sativa的同源性最高，高達83%。從NCBI上搜索到其他19個物種的TC蛋白序列，利用MEGA5.1軟件進行多重序列比對， 并構建系統發生樹（圖4）。結果表明，結果顯示紅花與向日葵、生菜的親緣關系相對較近，而與芝麻、煙草親緣關系相對較遠。

3.6 紅花TC基因的表達分析 分別取開花后5，15，30，50 d的新鮮種子提取RNA，反轉錄為cDNA。以18s rRNA為內參基因，采用Real-time PCR方法分析TC基因在紅花種子不同發育時期的表達量。結果表明（圖5），TC基因的表達量隨著種子的發育逐漸升高，在開花后50 d（成熟種子）中達到最高。干旱脅迫條件下，發現干旱脅迫6 d時TC基因的表達量達到最高值，隨后下降（圖6）。

4 結論

生育酚環化酶是Vit E生物合成途徑中的關鍵酶之一。本研究成功從紅花中克隆得到一個TC基因，ORF長長度為1 524 bp，編碼蛋白由507個氨基酸組成， 并且與其他植物TC蛋白具有較高的相似

性，所有的生物信息學分析表明CtTC屬于生育酚環化酶家族。CtTC基因的分離鑒定為分子水平上深入了解該基因在Vit E生物合成途徑中的作用奠定基礎，為培育富含高活性Vit E轉基因植物提供優質候選基因。

目前，大量的TC蛋白已在多種植物中發現。CtTC蛋白中的N端葉綠體轉運肽的預測說明TC合成后運送到葉綠體并在此行使功能，這與Vidi等發現的生育酚是在植物的葉綠體中合成是一致的^[16]。將不同植物的TC蛋白構建系統進化樹，CtTC與同為菊科的生菜、向日葵TC蛋白聚為一類。研究表明，TC能夠通過提高的α-生育酚含量和降低脂質過氧化水平，增強植物對干旱脅迫的耐受性^[17]。大量的證據表明生育酚含量與植物對低溫、干旱、鹽脅迫呈現正相關關系^[18-20]。脅迫條件下誘導Vit E合成途徑基因的表達能夠增強生育酚的積累，而這些基因包括TC基因對于不同的脅迫可能引起不同的反應^[21-22]。熒光定量PCR結果表明，CtTC基因的表達量隨著種子的發育逐漸升高，在紅花開花后50 d的種子中表達豐度最高；干旱脅迫6 d時TC基因的表達量達到最高值，隨后下降，說明更多的生育酚環化酶積累并參與Vit E的合成，Vit E可做為一種抗氧化劑，有效減弱干旱脅迫等條下件植物細胞膜與蛋白的氧化損傷。本研究對CtTC基因在氧化應激條件下的表達譜進行分析，結合上述蛋白序列的生物信息學分析，結果揭示CtTC在一定程度上應答氧化應激的潛在功能。

然而，有關CtTC參與Vit E生物合成的分子調控機制還有待進一步深入研究。在后續研究中，通過原核表達、超表達或抑制CtTC基因在植物中的表達，結合Vit E含量變化、紅花抗逆性的研究等對該基因進行功能驗證，為后續紅花Vit E的代謝調控研究奠定基礎。

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[責任編輯 呂冬梅]