從農藝性狀及化學成分測定分析遠志藥材商品品規和良種選育的合理性

王丹丹+白璐+許曉雙+張福生+邢婕+賈金萍+田洪嶺+秦雪梅

[摘要]通過對18份具有不同農藝性狀特征的遠志樣品進行農藝性狀（株高、根直徑、根長、第一側根分叉高度、側根數、根重）分析，并采用HPLC對18份遠志樣品的3個指標性化學成分（細葉遠志皂苷、遠志酮Ⅲ、3，6′-二芥子?；崽牵┻M行含量測定，最后通過散點圖分析6個農藝性狀與3個指標性化學成分的相關性。研究發現18份遠志樣品中的3個指標性化學成分含量與遠志根直徑均無明顯相關性，且細葉遠志皂苷含量與其余5個農藝性狀也無明顯相關性；遠志酮Ⅲ在主根長較短、第一側根分叉高度較短，側根數較多的遠志樣品中含量較高；3，6′-二芥子?；崽窃谥鞲L較長的遠志樣品中含量較高?？梢姮F行遠志藥材商品規格標準及等級劃分與良種選育方法，并不符合優等藥材其體內指標性化學成分含量較高的藥典標準，所以急需制訂出具有科學數據支撐的遠志商品規格等級標準及良種選育方法。

[關鍵詞]遠志； 農藝性狀； HPLC； 商品品規； 良種選育

[Abstract]The agronomic traits （plant height， root diameter， root length， first lateral root height， lateral root amount， root weight） of 18 Polygala tenuifolia samples with different agronomic traits were analyzed， respectively. HPLC was used to analyze three main characteristic components including tenuifolin， polygalaxanthone Ⅲ， and 3，6′-disinapoyl sucrose. At last， the correlation between six agronomic traits and three main characteristic components were analyzed by scatter plot. We found no significant correlation between root diameter and three main characteristic components. There were no obvious correlations between tenuifolin and the remaining five agronomic traits. Short root length and first lateral root height as well as high lateral root amount resulted in high levels of polygalaxanthone Ⅲ in P. tenuifolia samples. High levels of 3，6′-disinapoyl sucrose were observed in P. tenuifolia samples with longer root. So， the current commodity criteria and traditional breeding of P. tenuifolia did not conform to pharmacopoeia standards， which excellent medicinal materials should have high contents of the main characteristic components. It was urgent to revise the current commodity criteria and breeding methods.

[Key words]Polygala tenuifolia； agronomic traits； HPLC； commodity criteria； breeding

doi：10.4268/cjcmm20162006

遠志是我國常用的傳統大宗中藥材之一，始載于《神農本草經》，列為上品^[1]。2015年版《中國藥典》中收載的遠志，為遠志科植物遠志Polygala tenuifolia Willd.或卵葉遠志P. sibirica L.的干燥根，具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫等功效^[2]；其主要有效成分為皂苷類、酮類和糖酯類等化合物^[3]。關于商品遠志的品質，傳統“商品遠志以筒粗、肉厚、去凈木心之遠志筒為佳”^[4]?，F行的遠志藥材商品規格依然遵循1984年國家頒布的《七十六種藥材商品規格標準》^[5]，將遠志藥材劃分為志筒、志肉2種規格，其中志筒依據長度和中部直徑的大小，劃分為一等、二等2種等級，志肉只有統貨1種等級。而2015年版《中國藥典》則以細葉遠志皂苷（≥2.0%）、遠志酮Ⅲ（≥0.15%）、3，6′-二芥子?；崽牵ā?.50%）含量的高低，作為評價商品遠志質量優劣的標準^[2]。因此，遠志藥材的傳統商品規格及等級是否與上述3個指標性化學成分的含量有必然的相關性，這一問題值得商榷。

目前，根類中藥材新品種的傳統選育方法主要參考根及根莖類農作物，以藥材畝產量及根的農藝性狀等作為主要選育指標。由于無商品化的種子來源，遠志藥材的生產種植目前仍處于一個粗放式、自采自種的原始階段^[6]。長此以往，勢必會導致遠志品種的退化。因此，有必要且急需對遠志藥材進行良種選育。又因中藥材的質量優劣與其藥效的強弱密切相關，其藥效的強弱又與其體內有效化學成分含量的高低密切相關^[7]。而作為遠志藥材傳統良種選育的主要指標，根的農藝性狀是否與上述3個指標性化學成分含量有必然的相關性，這一問題同樣值得進一步商榷。

本文分別對18份具有不同農藝性狀特征的遠志樣品進行農藝性狀（株高、根直徑、根長、第一側根分叉高度、側根數、根重）分析，并采用HPLC對遠志的細葉遠志皂苷、遠志酮Ⅲ、3，6′-二芥子?；崽沁M行含量測定，最后通過散點圖分析6個不同農藝性狀與3個指標性化學成分間的相關性，進而探討遠志藥材傳統商品規格等級劃分及良種選育方法的合理性。

1 材料

1.1 植物

本實驗依托于山西省農科院經濟作物研究所（以下簡稱經作所）。經作所先后從山西省內、外征集17份遠志資源，并分別種植于經作所試驗田。之后將征集到的所有遠志種質資源利用系統選育法，從中選育出18個具有不同農藝性狀的優良株系，并編號便于管理。本文所用18份遠志樣品均于2010年7月在遠志新品種選育資源保存圃播種，依據大田管理細則進行統一管理，并于2013年11月采挖全植株（包括地上部分和地下部分），放置于陰涼通風處干燥。樣品經秦雪梅教授鑒定為遠志P. tenuifolia，憑證標本均保存于山西大學中醫藥現代研究中心。具體樣品信息見表1。

1.2 儀器及試劑

Waters 高效液相色譜儀：高壓泵（Waters 1525，美國）；紫外檢測器（Waters 2487，美國）；Breeze 色譜工作站；色譜柱：agela-Venusil XBP C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm，中國）；RE-52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

細葉遠志皂苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號 MUST-140428801，純度≥98%）；遠志酮Ⅲ對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號 MUST-14100905，純度≥98%）；3，6′-二芥子?；崽菍φ掌罚ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號 111848-201303，純度以96%計）。

2 方法

2.1 農藝性狀的測定

按順序從18個保存圃中隨機選取6～10株遠志樣品進行采挖，采挖植株的同時，測量并記錄以下4個農藝性狀：株高（cm）、根長（cm）、第一側根分叉高度（cm，蘆頭到第1個側根的長度）、側根數（個）；待根干燥后，測量并記錄以下2個農藝性狀：根直徑（cm，由于遠志藥材的根長在20 cm左右，且根頂部的直徑與底部的直徑沒有太大的差異，所以將蘆頭下3 cm處主根的直徑認為是根的直徑）及根重（g）。

2.2 指標性化學成分的含量測定

細葉遠志皂苷、遠志酮Ⅲ和3，6′-二芥子?；崽堑暮繙y定方法均參照2015年版《中國藥典》一部中遠志的含量測定項下的高效液相色譜法進行測定^[2]。

2.2.1 細葉遠志皂苷的含量測定 對照品溶液及供試品溶液的制備方法參照2015年版《中國藥典》。

色譜條件：以甲醇-0.05%磷酸溶液（70∶30）為流動相；檢測波長 210 nm；流速1.0 mL·min^-1；運行時間30 min。每個測試樣品均平行備樣2份，并且每份樣品平行進樣2針，每次進樣10 μL。

2.2.2 遠志酮Ⅲ和3，6′-二芥子?；崽堑暮繙y定 對照品溶液及供試品溶液的制備方法參照2015年版《中國藥典》。

色譜條件：以乙腈-0.05%磷酸溶液（18∶82）為流動相；檢測波長為320 nm；流速1.0 mL·min^-1，運行時間40 min。每個測試樣品均平行備樣2份，并且每份樣品平行進樣2針，每次進樣10 μL。

2.3 數據處理

各項農藝性狀均以±s表示，3個指標性化學成分含量以表示，并基于SPSS 16.0（IBM SPSS，USA）軟件，分別依據18份遠志樣品的農藝性狀和3個指標性化學成分含量進行聚類分析，并分別對農藝性狀和3個指標性化學成分含量進行相關性分析。最后，采用OriginPro 8軟件（originlab，USA）對6個農藝性狀與3個指標性成分的含量做散點圖^[8]，分析農藝性狀和指標性成分之間的相關性。

3 結果與分析

3.1 遠志農藝性狀分析

3.1.1 6個農藝性狀的測定結果與分析 18份遠志樣品的農藝性狀均存在顯著性差異，見表2。結果表明：①株高的變化范圍為18.23～31.71 cm，平均22.96 cm；其中4號樣品的平均株高最高，為31.71 cm；15號樣品的平均株高最低，為18.23 cm。②根直徑的變化范圍為0.29～0.50 cm，平均0.42 cm；其中13號樣品的平均直徑最大，為0.50 cm；1號樣品的平均直徑最小，為0.29 cm。③根長的變化范圍為15.93～21.65 cm，平均19.06 cm；其中6號樣品的平均根長最長，為21.65 cm；8號樣品的平均根長最短，為15.93 cm。④第一側根分叉高度的變化范圍為3.92～10.19 cm，平均6.33 cm；其中5號樣品的平均根分叉高度最長，為10.19 cm；18號樣品的平均根分叉高度最短，為3.92 cm。⑤側根數的變化范圍為2.09～7.82個，平均4.25個；其中14號樣品的平均側根數最多，為7.82個；1號樣品的平均側根數最少，為2.09個。⑥根重的變化范圍為1.20～4.58 g，平均2.82 g；其中13號樣品的平均單株根重最大，為4.58 g；1號樣品的平均單株根重，為1.20 g。

各項農藝性狀指標的變異系數（coefficient of variance，CV，變異系數=均方差/平均值）^[9]從大到小，依次為側根數>根重>第一側根分叉高度>株高>根直徑>根長。樣品性狀的變異系數越大，則遺傳多樣性越大，良種選育時選擇潛力越大^[10]。其中，側根數的變異系數（0.384）最大，可選擇的范圍也最寬，選擇效果最好^[11]；而根長的變異系數（0.078）最小，可選擇的范圍最窄。第一側根分叉高度與遠志抽心的難易程度密切相關，其變異系數為0.254，說明可選擇的空間較大；而根重與遠志的產量密切相關，其變異系數為0.299，可見也有一定的選擇空間。綜上可知，18份遠志樣品的6個不同農藝性狀均存在著不同的變異幅度。

3.1.2 18份遠志藥材樣品的農藝性狀特征聚類分析 在目前的實際應用中，系統聚類法（hierarchical clustering methods，也稱層次聚類法）和K均值聚類法（K-means）是聚類分析中最常用的2種方法。系統聚類法由于類與類之間的距離計算方法靈活多樣，使其可以適應不同的要求，該方法是目前實踐中使用最多的，其中離差平方和法（Ward′s method）分類效果較好，應用比較廣泛。需要注意的是，采用離差平方和法，樣本間的距離必須采用歐氏距離（Euclidean distance）^[12]。

因此本文采用SPSS 16.0軟件中的離差平方和法對18份遠志樣品的農藝性狀數據進行聚類分析，見圖1。18份樣品明顯分為3組，其中第一組包括6個遠志樣品（3，12，8，6，17，13），它們的株高中等，根直徑和根重最高；側根數較多，第一側根分叉高度較短，屬于產量較高，但比較難抽心的類型。第二組也包括6個遠志樣品（10，15，7，16，1，5），它們的株高，根直徑和根重最低；側根數較少，第一側根分叉高度較長，屬于產量較低，但比較容易抽心的類型。第三組也包括6個遠志樣品（2，11，9，14，16，4），它們的株高最高，根直徑和根重中等；側根數和第一側根分叉高度也處于中等水平，屬于產量中等，抽心難易程度也處于中等水平的類型。每組中根長比較穩定，所以可推測18份遠志樣品并不是依據根長來進行分組的。

3.1.3 不同農藝性狀特征間的相關性分析 相關性分析目前應用最廣的為Pearson相關和Spearman秩相關，其中Pearson相關要求原數據服從正態分布，而Spearman秩相關屬于非參數檢驗，并不知道物種服從何種分布，用起來更為靈活方便^[13]。

經過檢驗，側根數和根重不符合正態分布，所以采用Spearman秩相關對各農藝性狀進行相關性分析，見表3。結果表明：①株高與根直徑、側根數、根重呈極顯著（P<0.001）正相關；②根直徑與側根數、根重呈極顯著正相關，與第一側根分叉高度呈極顯著負相關；③根長與根重呈極顯著正相關；④第一側根分叉高度與側根數呈極顯著負相關；⑤側根數與根重呈極顯著正相關。

可見遠志藥材根直徑越粗、根長越長、根重越重，則遠志藥材的產量越高，而遠志藥材的側根數越多，第一側根分叉高度越短，則越不利于遠志藥材的抽心處理?？筛鶕鬓r藝性狀間的相關性，對某一性狀進行間接選擇，并且可取得良好的選擇效果^[10]。

3.2 遠志指標性化學成分分析

3.2.1 3個指標性化學成分含量測定結果與分析 在本實驗的色譜條件下，遠志樣品中的細葉遠志皂苷、遠志酮Ⅲ和3，6′-二芥子?；崽欠宸蛛x度均大于1.5，可完全分離，峰型窄而且對稱。分別測定18份遠志樣品的3個指標性化學成分的含量，結果見表4。

結果表明，所有18份遠志樣品，①細葉遠志皂苷平均含量為3.04%，其中含量最高的為15號樣品，質量分數為4.07%；含量最低的為12號樣品，質量分數為1.80%。除12號遠志樣品外，均符合藥典標準（≥2.0%）。②遠志酮Ⅲ的平均質量分數為0.20%，其中含量最高的為8號樣品，質量分數為0.46%；含量最低的為5號樣品，質量分數為0.08%。其中2，5，6，10，11，16，18號遠志樣品的遠志酮Ⅲ含量均不符合藥典標準（≥0.15%）。③3，6′-二芥子?；崽堑钠骄|量分數為0.72%，其中含量最高的為12號樣品，質量分數為1.17%；16號樣品含量最低，質量分數為0.47%，次之為2號樣品，其質量分數為0.48%。除2號、16號遠志樣品外，其余樣品均符合藥典標準（≥0.50%）。由表4可見，同一成分在18份遠志樣品中的含量明顯不同，且不同成分的波動范圍也明顯不同。其中細葉遠志皂苷的變異系數最小，為0.155，說明細葉遠志皂苷的含量與樣品的直徑無關；3，6′-二芥子?；崽堑淖儺愊禂稻又?，為0.239；而遠志酮Ⅲ的變異系數最大，為0.473，并且18份遠志樣品中有7份樣品不符合藥典規定，說明遠志藥材中遠志酮Ⅲ的含量可能比細葉遠志皂苷的含量更容易隨外界因素發生變化。因此，推測藥典中規定的遠志酮Ⅲ的質控下限值可能有些偏高，可適當降低含量標準，且以遠志酮Ⅲ為指標性成分用于遠志藥材商品規格等級的劃分值得商榷。

3.2.2 18份遠志藥材樣品的指標性成分聚類分析 本文采用SPSS 16.0軟件中的離差平方和法對18份遠志樣品的農藝性狀數據進行聚類分析，見圖2。18份樣品明顯分為2組，其中第一組包括15個遠志樣品（6，10，11，9，18，5，1，13，14，2，16，4，7，8，15），它們的細葉遠志皂苷含量較高，遠志酮Ⅲ含量較低，3，6′-二芥子?；崽呛枯^低。第二組包括3個遠志樣品（3，17，12），它們的細葉遠志皂苷含量較低，遠志酮Ⅲ含量較高，3，6′-二芥子?；崽呛枯^高。

3.2.3 不同指標性成分含量間的相關性分析 經過檢驗，各指標性成分含量符合正態分布，用Pearson相關對各指標性成分含量間進行相關性分析，見表5。結果表明：①細葉遠志皂苷含量與遠志酮Ⅲ含量之間呈現顯著負相關（P<0.05）；②3，6′-二芥子?；崽呛颗c細葉遠志皂苷含量和遠志酮Ⅲ含量分別呈負相關，但無統計學意義。由此推測：細葉遠志皂苷的含量越高，則遠志酮Ⅲ的含量越低，這與遠志藥材樣品的指標性成分聚類結果一致。

3.3 3個指標性化學成分含量與不同農藝性狀特征間的相關性分析

本研究對6個農藝性狀與3個指標性成分的含量分別做散點圖，見圖3。結果表明：①細葉遠志皂苷的含量在6個不同農藝性狀中的含量變化范圍較大，無明顯的變化規律；②遠志酮Ⅲ的含量與根長（圖3C）、第一側根分叉高度（圖3D）呈負相關（圖中代表遠志酮Ⅲ含量的點從左至右分布在一條斜率向下的直線上），與側根數（圖3E）呈正相關（圖中代表遠志酮Ⅲ含量的點從左至右分布在一條斜率向上的直線上），與其他農藝性狀無明顯的變化規律；③3，6′-二芥子?；崽堑暮颗c根長（圖3C）呈正相關（直線斜率向上），與其他農藝性狀無明顯的變化規律。

以上結果提示：細葉遠志皂苷的含量高低與6個農藝性狀無明顯相關性；遠志酮Ⅲ在根較短，第一側根分叉高度較短，側根數較多的樣品中含量較高；3，6′-二芥子?；崽窃诟^長的樣品中含量較高。

18份樣品依據農藝性狀得到的聚類分組（圖1）和依據指標性化學成分含量得到的聚類分組（圖2）并不完全相同，這可能是由于同一物質的不同屬性造成不同的分組結果。圖1中根直徑最高的一組（3，17，12，8，6，13），依據3個指標性成分含量進行分組，被分到了不同的2組中，說明3個指標性化學成分的含量與根直徑無關；并且3號、17號和12號在2個聚類圖中都被分到了同一組，這3份樣品具有側根數較多，第一側根分叉高度較短的農藝性狀，且遠志酮Ⅲ的含量較高，這與圖3得到的結果一致。由于3，6′-二芥子?；崽堑暮颗c根長有關，但是農藝性狀的聚類分組并不是依據根長進行的，所以圖3的結果是對圖1和圖2結果的補充，得到3，6′-二芥子?；崽窃诟^長的樣品中含量較高的結論。

4 討論

本文研究結果表明，18份遠志樣品中的3個指標性化學成分含量與遠志根直徑均無明顯相關性，因此本文認為，現行的依據是否抽心以及根的粗細等來劃分遠志藥材的商品規格與等級，并依據遠志藥材的畝產量及根的農藝性狀等作為遠志良種選育主要指標，存在一定的片面性。

4.1 現有遠志藥材商品規格標準與等級劃分的不足

自古以來，中藥材作為一種特殊的商品，已形成“看貨評級，分檔議價”的經驗判別方法^[14]，“辨狀論質”在中藥材商品規格等級方面始終起著理論指導作用^[15]?，F行的遠志商品規格標準依然遵循《七十六種藥材商品規格標準》對遠志藥材商品規格和等級的劃分標準^[5]。目前市場上出售的遠志飲片大多是經過抽心處理的志筒或志肉，但目前關于遠志是否抽心仍尚無明確定論^[16-17]。并且市場上流通的遠志藥材，已遠遠超出了志筒、志肉這2種規格，出現了志筒與遠志根（或者志肉、蘆頭等）按不同比例摻雜的多種規格；不同規格又按抽心率的大小及遠志筒（根）的粗細來劃分遠志藥材的等級，且市場中沒有明確的行業標準^[18]，導致市場中商品規格標準及等級劃分比較混亂。

化學成分作為中藥材發揮藥效的物質基礎，從理論上看，藥材的規格等級與化學成分含量之間似乎應存在某種必然聯系，但事實并非如此，如川芎（不同規格川芎4種化學成分含量均無顯著性差異）^[19]、款冬花（優級款冬花樣品中蘆丁平均含量略高于統貨樣品，但二者差別不大）^[20]、白芍（指標性成分含有量最高的是傳統規格的三等白芍）^[21]等藥材的商品規格等級與化學成分含量之間沒有明顯的相關性。房敏峰等^[22]利用HPLC測定不同商品規格等級的遠志樣品中遠志皂苷元的含量，發現一級筒中皂苷元含量低于二、三級筒。本課題組曾對不同規格遠志藥材中的3個指標性化學成分的含量進行測定^[23]，發現：①不同批次遠志樣品間細葉皂苷的含量差異較大，無明顯規律，說明細葉遠志皂苷含量與遠志樣品直徑無關，與本文結論一致；②遠志酮Ⅲ的含量在遠志筒中含量變化范圍較窄，在根中比較離散，說明遠志酮Ⅲ的含量與遠志樣品直徑無關，與本文結論一致；③除1號野生品外，3，6′-二芥子?；崽堑暮?，在遠志樣品中變化范圍較窄，說明3，6′-二芥子?；崽堑暮颗c遠志樣品直徑無關，與本文結論一致。上述結果與現行遠志藥材商品規格^[5]相矛盾。由此可見，現有遠志藥材的商品規格標準及等級劃分，在市場定價及流通環節上無法起到應有的指導作用，而上述現象在不同藥材品種中也有發生。有學者認為應將藥材的化學成分與外觀性狀結合起來評價商品規格標準及等級劃分的科學性及合理性^[24]，以及用生物活性來反映商品規格及等級的內涵^[25]。因此，本文建議先按照遠志是否抽心將遠志藥材劃分為遠志筒與遠志根2種規格，再分別按照形態、有效成分含量、生物活性等將不同規格的藥材劃分為不同的等級。

4.2 遠志藥材傳統良種選育方法的不足

遠志的良種選育是建立規范化、規?；N質的基礎，能從根本上解決目前遠志生產上存在的品種混亂、種質退化、產量下降、質量參差不齊、生產潛力不足等問題，使遠志藥材生產朝著優質、高產、質量穩定的方向發展，實現資源的可持續利用。目前遠志的良種選育主要經歷“引種—馴化—選種”等過程，且選育出一個新品種需要經歷幾年甚至十幾年的時間。經作所歷經16年（1996—2012年），對遠志各生育期觀察和通過抗性、產量性狀等比較，選育出我國第一個遠志品種——晉遠1號^[26]。相對于農作物以產量優先兼顧品質，中藥材則首先應以品質（整齊度、質量指標）為先，其次再考慮其產量、抗性等^[27]。因此，現階段有必要制訂更加系統的良種選育方法，加快遠志良種選育的進程，如采用代謝組學技術、DNA分子標記技術等對遠志良種進行質量評價和鑒定，同時應加強植物次生代謝產物生物合成的分子調控研究等^[28]。同時，本文研究結果表明，遠志酮Ⅲ在主根長較短、第一側根分叉高度較短，側根數較多的遠志樣品中含量較高；3，6′-二芥子?；崽窃谥鞲L較長的遠志樣品中含量較高，這為今后遠志的良種定向選育（以目標活性物質含量的高低為依據）提供了依據。

綜上所述，中藥材“辨狀論質”是幾千年中醫藥傳統經驗的總結，既有合理內涵，也存在一定的局限性。因此在制訂遠志藥材商品規格標準及等級劃分和篩選優良種質資源時，不僅要繼承傳統經驗方法，還應綜合考慮藥材中有效成分含量及生物活性等；此外，在進行遠志藥材的良種選育時，可根據選育用途來確定目標性狀，在藥效優先的情況下，兼顧產量，最終使研究成果能遵循科學、合理、實用性的原則。

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[責任編輯 呂冬梅]