復方血栓通膠囊化學成分在比格犬眼球和腎臟內的分布研究

江美芳+王勤輝+龐歡歡+田悅+王曉燁+孫璐+高偉+黃建梅

[摘要]糖尿病視網膜病變（DR）和糖尿病腎?。―N）是最常見的糖尿病并發癥，也是糖尿病致死致殘的主要原因，臨床報道顯示復方血栓通膠囊對DR和DN均有較好的治療作用，但復方血栓通膠囊中的化學成分在眼球和腎臟中的分布尚無報道，該研究主要探索復方血栓通膠囊中的化學成分在比格犬眼球和腎臟中的分布情況。比格犬連續灌胃給予復方血栓通膠囊3 d后，取眼球和腎臟，運用高效液相色譜-高分辨液質聯用技術LTQ-Orbitrap鑒定其中的化學成分，通過與對照品及相關文獻中化學成分的精確相對分子質量、保留時間以及二級碎片信息比對，確認化合物。該研究在眼球和腎臟中分別鑒定出14，19個三七皂苷類成分。鑒定結果為闡釋復方血栓通膠囊在治療DR和DN的有效成分奠定了一定的物質基礎。

[關鍵詞]復方血栓通膠囊； 三七皂苷； 眼球； 腎臟； HPLC LTQ-Orbitrap

[Abstract]Diabetic retinopathy（DR） and diabetic nephropathy（DN） are the most common complications of diabetes， and the main causes of death and disability of diabetes. Clinical reports showed that Fufang Xueshuantong capsule（FXT） had effective curative effect on DR and DN， but there was no report on the distribution of chemical compounds of FXT in beagle dog eyes and kidneys. In this study， FXT was given by gavage administration in Beagle dogs for 3 days， and then their eyeballs and kidneys were taken. The chemical compounds in beagle dog eyes and kidneys were detected by HPLC LTQ-Orbitrap technology. Furthermore， by comparing with the data from retrieving literature and references， the chemical compounds were identified by the accurate mass， retention time （t_R）， and MS/MS. Fourteen and 19 types of notoginsenosides were respectively identified in eyeballs and kidneys in this study， and these results could lay foundation for clarifying the effective ingredients of FXT in treatment of DR and DN.

[Key words]Fufang Xueshuantong capsule； notoginsenosides； eyeball； kidney； HPLC LTQ-Orbitrap

doi：10.4268/cjcmm20162022

糖尿病是一種常見疾病，它不僅導致機體代謝紊亂，而且可引起多個系統的并發癥，嚴重影響人類健康。糖尿病并發癥，是糖尿病致死致殘的主要原因。糖代謝異常導致血管、神經以及組織器官的損傷，其中糖尿病眼病、糖尿病腎病是最常見的糖尿病微血管并發癥之一，目前對該類疾病的治療藥物較少。復方血栓通膠囊是中山大學中山眼科中心與廣東眾生藥業股份有限公司共同研制開發的純中藥復方制劑，由君藥三七、臣藥丹參、佐使藥黃芪、玄參4味藥組成。三七占全方的54.3%，具有活血化瘀、益氣養陰的功效。復方血栓通膠囊在眼科疾病中廣泛應用，尤其是對糖尿病視網膜病變療效顯著^[1-3]。同時，相關文獻報道^[4-5]，復方血栓通膠囊能較好的改善腎功能，對糖尿病腎病具有保護作用。

在中醫理論的指導下， 中藥的藥效物質基礎，即具有臨床療效的有效成分，是探索中藥功效與其作用的本質與核心，是中藥現代化發展的基礎^[6]。課題前期已對復方血栓通膠囊入血成分及糞、尿中的代謝成分進行了研究，但對復方血栓通膠囊在組織器官中的化學成分分布情況未見相關報道，有關復方血栓通膠囊治療糖尿病眼病和腎病的物質基礎研究較薄弱，前期研究結果顯示復方血栓通膠囊進入體內的主要為三七皂苷類成分，故三七皂苷類成分為研究的重點關注對象。

二維線性離子阱（LTQ）-Orbitrap是一種新型質譜儀，具有很高的靈敏度和分辨率，能夠提供高精度的質量數，從而得到可能的元素組成信息；能夠獲得化合物豐富的多級質譜信息從而利于化合物的結構鑒定^[7-8]；同時，母離子列表（parent ion list， PIL）以及選擇離子監測（select ion monitoring， SIM）檢測方式結合數據依賴性掃描，可以輔助達到目標化合物以及微量/痕量成分快速檢測的目的^[9]。無論是常規化合物鑒定還是要求更為嚴格的復雜體系中痕量物質的分析，該質譜系統優越的檢測性能使之在各個領域得到迅速應用^[10-11]。

為了進一步闡釋復方血栓通膠囊治療DR和DN的物質基礎，本研究運用高分辨液質聯用技術HPLC LTQ-Orbitrap鑒定給予復方血栓通膠囊后比格犬眼球和腎臟中的三七皂苷類成分。

1 材料

結合型傅立葉變換高分辨質譜 Thermo-Fisher LTQ-Orbitrap XL（Thermo Fisher Scientific， USA），配有Accela 600 pump HPLC液相系統（Thermo， USA）。

復方血栓通膠囊（批號150421）購自廣東眾生藥業股份有限公司；原人參三醇（PPT）型皂苷：人參皂苷Re（MUST-15031711），Rg₁（MUST-16022407），Rg₂（MUST-14040919），Rh₁ （MUST-15052717），三七皂苷R₁（MUST-16041806）， R₂；原人參二醇（PPD）型皂苷：人參皂苷Rg3（批號MUST-15082211），Rb₁（MUST-16021907），F₂（批號MUST-16032202），Rh₂（MUST-14031112），Rd（MUST-16012503），七葉膽皂苷ⅩⅦ（MUST-16040617），均購自成都曼斯特生物科技有限公司。

色譜級甲醇和乙腈購自Fisher科技（美國）有限公司，質譜級甲酸購自Sigma化學有限公司。

2 方法

2.1 溶液的制備 復方血栓通膠囊混懸液的制備：復方血栓通膠囊去殼，稱取藥物粉末，配制成質量濃度約為0.25 g·mL^-1的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸溶液，備用。

對照品溶液的制備：精密稱取三七皂苷類對照品適量，用甲醇定容，配制成一定濃度的混標溶液。

2.2 動物給藥方案和生物樣品的采集 雄性比格犬，2只，每只重10 kg左右，購自北京市沙河通利試驗動物養殖場。

健康雄性比格犬2只，隨機分為空白組和給藥組，給藥前禁食12 h（不禁水）。按照4 mL·kg^-1（即1 g·kg^-1）給比格犬灌胃，每日1次，連續給藥3 d，于第3天給藥后2 h注射戊巴比妥鈉溶液處死，取眼球和腎臟，用生理鹽水清洗干凈，于-80 ℃冰箱保存。

2.3 生物樣品的前處理 取給藥犬眼球，稱重，除去外膜，加入2倍量生理鹽水，勻漿機充分攪碎，取勻漿液2 mL，加入3倍量甲醇，渦旋1 min，12 000 r·min^-1離心15 min，取上清液室溫下氮氣吹干，殘渣用200 μL甲醇-水（5∶1）復溶，進樣 10 μL，進行 LC-MS/MS 分析?？瞻籽矍?、腎臟前處理同給藥眼球。

2.4 液質條件 色譜條件：采用 XBridge C₁₈色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），聯有Phenomenex C₁₈預柱（0.3 mm×4 mm，5 μm），流動相 A 為乙腈，B 為 0.1%甲酸水，梯度洗脫（0～10 min，20%～22%A；10～15 min，22%A；15～18 min，22%～31%A；18～30 min，31%～32%A；30～35 min，32%～63%A；35～40 min，63%A；40～45 min，63%～83%A），流速 1.0 mL·min^-1，柱溫為室溫。

質譜條件：ESI 源，負離子模式，毛細管溫度 350 ℃，鞘氣流速 30單位，輔助氣流速 10單位，噴霧電壓3 kV，毛細管電壓-35 V，管透鏡電壓-110 V，樣品先進行全掃描，分辨率 R 設為3萬，掃描范圍 m/z 100～1 500，二級和三級質譜采用動態數據依賴性掃描（data dependent scan，DDS），選取上一級豐度前三強的峰進行碰撞誘導解離（CID）碎片掃描，以離子阱打拿極（dynode） 檢測。

2.5 數據處理 高分辨數據處理軟件釆用 QualBrowser of Xcalibur 2.1 （Thermo Fisher Scientific ）。該軟件可進行化合物的提取鑒定（EIC），元素組成預測誤差在5。

3 結果與討論

3.1 三七皂苷對照品HPLC-MS規律分析 在流動相中含有0.1%甲酸、負離子條件下，三七皂苷類成分主要以[M+COOH]-和[M-H]-2種離子形式存在，其中 [M-H]-的響應強度一般較低。

在二級質譜中，三七皂苷類成分主要經過CID裂解產生脫去糖基后的碎片離子和皂苷苷元（人參三醇苷元和人參二醇苷元）的碎片離子。糖基主要有葡萄糖（m/z162）、鼠李糖（m/z146）、阿拉伯糖（m/z132）、木糖（m/z132）；二醇型皂苷常產生的共同碎片離子有m/z621 （C₄₂H₇₁O₁₃^-，苷元+C₆H₁₀O₅-H^-）、459（C₃₀H₅₁O₃^-，苷元-H^-） 和375（C₂₄H₃₉O₃^-，苷元-C₆H₁₂-H^-），三醇型皂苷常產生的共同碎片離子有m/z637（C₃₆H₆₁O₉^-，苷元+C₆H₁₀O₅-H^-）、475（C₃₀H₅₁O₄^-苷元-H^-）和391（C₂₄H₃₉O₄^-， 苷元-C₆H₁₂-H^-）。根據以上特征，能更好更快的鑒定三七皂苷類成分。

3.2 三七皂苷類成分的鑒定 結合3.1項下皂苷特點，通過化合物的精確相對分子質量、二級碎片信息以及保留時間，與對照品或者文獻比對，對化合物進行鑒定，鑒定結果圖1，2和表1。

化合物M3（t_R8.6 min）：該化合物的加合離子峰m/z977.528 0 [M+COOH]^-，準分子離子峰m/z 931.521 7 [M-H]^-，通過數據處理軟件推測其分子式為C₅₅H₉₃O₂₅。該化合物二級碎片離子m/z637，475，391為PPT型皂苷產物離子，推測該化合物為三七皂苷類成分。其二級碎片主要通過丟失糖基產生，m/z799.53為m/z931.53丟失1個木糖基（m/z132）的離子[M-H-Xyl]^-，m/z769.43為m/z931.53丟失1個葡萄糖基（m/z162）的離子[M-H-Glc]^-，m/z637.43為m/z769.43丟失1個木糖基（m/z132）或m/z799.53丟失1個葡萄糖基（m/z162）的離子[M-H-Xyl-Glc]^-，m/z475.46為m/z637.43丟失1個葡萄糖基（m/z162）的離子（[M-H-Xyl-Glc]^-），m/z391.31為m/z475.46進一步丟失C-20位連接的脂肪鏈所得的離子[M-H-Xyl-2Glc-84]^-。與對照品三七皂苷R₁的精確相對分子質量、保留時間以及二級碎片信息一致，故確認該化合物為三七皂苷R₁。

化合物M5，M20，M21：具有相同的加合離子峰m/z991.54 [M+COOH]^-和準分子離子m/z945.54 [M-H]^-，保留時間分別為11.5，33.0，33.9 min。經CID裂解，M20和M21均通過丟失糖基產生碎片離子m/z783[M-H-Glc]^-和621[M-H-2Glc]^-，見表1。M20和M21與對照品七葉膽皂苷ⅩⅦ和人參皂苷Rd的精確相對分子質量、保留時間以及二級碎片信息均一致，故推測化合物M20為七葉膽皂苷ⅩⅦ，M21為人參皂苷Rd。而化合物M5經CID裂解后，丟失一系列糖基產生碎片離子m/z783[M-H-Glc]^-，637[M-H-Glc-Rha]^-，475[M-H-2Glc-Rha]^-， 其中m/z637，475為三醇型皂苷常見碎片離子，與M20，M21不同，與對照品人參皂苷Re精確相對分子質量、保留時間以及二級碎片信息一致，故推測化合物M5為人參皂苷Re。

其余化合物皆可同樣推導，其中化合物M1～M2，M6～M11，M16～M19，M23無對照品，與參考文獻比對確定結構^[12-15]。

4 討論

復方血栓通膠囊灌胃后，運用高效液相色譜-高分辨液質聯用技術鑒定出比格犬眼球和腎臟內三七皂苷類成分分別14個和19個。

由于基質效應，以及三七皂苷類成分生物利用度等影響，生物樣品中三七皂苷類成分檢測率較低，采用全掃描模式，無法獲取低豐度皂苷的二級碎片信息。因此本研究在全掃描的基礎上，加以母離子列表掃描模式，針對性的獲取濃度較低化合物的二級碎片信息，對這類皂苷成分進行進一步確認。

三七皂苷類成分在眼球和腎臟中主要以原型形式存在。由于血眼屏障作用，進入眼球中的三七皂苷類成分種類較少，進入眼組織的三七皂苷類成分主要為低相對分子質量皂苷，連接糖基個數主要為1～3個，極個別連接糖基個數為4個，如人參皂苷Rb₁。進入腎臟中的三七皂苷類成分糖基個數主要為3～5個，有較少數連接糖基個數為1～2個，如人參皂苷F₂，三七皂苷R₁，腎臟中的三七皂苷類成分主要以原型形式存在，但個別皂苷為取代型皂苷，以取代形式存在，如化合物M6，M7為乙?；〈碥?，化合物M17，M19為丙?；〈碥?。這些三七皂苷類成分可能為治療糖尿病視網膜病變和腎病的有效成分。

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[責任編輯 曹陽陽]