槲皮素對兔骨關節炎模型關節液中IL—1β、TNFα水平的影響

劉俊　胡軍祖　陳蕾　孫巖　樊顏偉

摘要：目的：觀察中藥槲皮素對骨關節炎動物模型關節液中細胞因子IL-1β、TNFα水平的影響。方法：按照hulth法建立兔膝關節骨關節炎模型，20只實驗動物隨機等分成4組：①槲皮素組。②塞來昔布組。③生理鹽水組。④模型組。各治療組分別給予藥物治療4周，然后抽取關節液。ELISA法檢測關節液中IL-1β、TNF α的含量。結果：槲皮素組、塞來昔布組關節液中.IL-1β、TNFα水平均顯著低于模型組（P<0.01）。結論：槲皮素、塞來昔布能夠抑制OA模型關節滑液中IL-1B、TNFα的水平。、

關鍵詞：骨關節炎；槲皮素；塞來昔布

中圖分類號：Q959.836；R684.3 文獻標志碼：A 文章編號：1008—2409（2015）04—0005—04

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種隨著年齡增長而發病率也逐漸增加的進行性關節疾病，發病機理至今尚未十分明確，故也沒什么特效的治療藥物。近年的研究表明炎性細胞因子IL-1β、TNFα在OA的發生發展過程中起到了非常重要的作用，OA動物模型及OA的關節中均檢測出較高水平破的IL-1β與TNFα，IL-1β和TNFα是主要炎性細胞因子參與骨關節炎（OA）。這些細胞因子干擾軟骨細胞代謝，抑制細胞外基質蛋白的合成，促進分解代謝的蛋白酶的釋放，壞了軟骨細胞，從而形成骨關節炎，被認為是在關節炎發病機制中起關鍵作用的促炎癥性細胞因子。IL-1β是重要的炎癥介質，參與關節軟骨破壞的起始和進展。在正常人關節液中IL-1含量極少，IL-1B占主要成分。然而在OA患者關節液中IL-1B含量明顯升高，且與OA的病理表現呈正相關。TNFα可刺激滑膜細胞產生PGE2，增加軟骨下骨的吸收，引起關節軟骨Ⅱ型膠原的破壞，并且與OA的疼痛有著密切的關系，此外OA發生時滑膜細胞和軟骨組織大量分泌TNFα，促使滑膜組織的增生，并誘導成纖維細胞增生，形成大量的血管翳，致關節軟骨破壞，最終可以導致關節功能障礙。

中醫藥治療是我國防治骨關節炎的一大特色，中藥不僅可以調節機體免疫功能、減少復發及改善特應性體質，許多中藥還可減少蛋白酶和細胞因子的形成，對于骨關節炎疼痛的緩解，關節功能的改善有明顯的療效，且不良反應小，槲皮素又稱櫟精、槲皮黃素等，是一種植物源性五羥基黃酮類化合物，具有較高的營養與藥用價值。槲皮素多以苷的形式存在于一些水果、蔬菜和草本植物中。槲皮苷等在經過酶或酸作用后，水解成槲皮素。日前已在上百種中草藥中發現槲皮素的存在，且已有研究證實槲皮素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、免疫調節等多種生物活性，榭皮素對硝化應激誘導損傷的細胞具有保護作用，其機制可能與榭皮素可提高細胞內ERK通路有關。

實驗探討槲皮素對兔骨關節炎模型關節液中IL-1β、TNFot水平的影響作用機制，為臨床應用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康成年雄性新西蘭白兔22只，體重2.0～2.5 kg，由桂林醫學院實驗動物中心提供。

1.2實驗藥品與試劑

槲皮素：由北京友誼醫院中藥房煎制；塞來昔布：200 mg/粒，由美西爾大藥廠生產；家兔細胞因子IL-1B、TNFot ELISA檢測試劑盒，由解放軍301醫院放免所提供。

1.3實驗儀器

-20℃低溫冰箱；恒溫箱；離心機；SN-695B型放免測量儀；普通病理設備。

1.4動物模型與實驗分組

22只新西蘭兔2只留做檢測模型是否成功用，其余22只隨機分為4組；每組5只。于動物手術室切斷前交叉韌帶，參照文獻方法建立Hulth模型：將動物從耳緣靜脈麻醉后仰臥于手術臺上，無菌條件下取膝關節內側縱切口長約2 cm，顯露膝關節，然后切斷前交叉韌帶及內側副韌帶，完整切除內側半月板，保留關節軟骨面，手術后不固定傷肢，給予自由活動，給予青霉素20×10⁴/d肌肉注射3 d，預防感染，手術后7 d驅趕動物在小動物跑臺上奔跑，30min/d，分2次驅趕，驅趕動物4周后即得明顯的模型。4周后處死檢測兔，解剖膝關節并行大體觀察及取股骨內髁關節軟骨標本送普通病理檢查，結果證實兔膝關節骨關節炎模型制作成功（圖1、2）。

1.5實驗方法

1.5.1模型成功后即給予藥物治療①槲皮素組：榭皮素每日藥汁灌胃10.31 mg·kg^-1d^-1。②塞來昔布組：塞來昔布每日灌胃1次，20 mg/次。③鹽水組：每日灌胃生理鹽水10.31 mg·kg^-1·d^-1。④空白組：無藥物治療。全部動物治療飼養4周，然后抽取關節液。

1.5.2抽取關節液：施行膝關節穿刺抽取關節液，用2.5 ml一次性無菌注射器加入生理鹽水1 ml對膝關節反復抽吸使沖洗液混勻，最后抽干膝關節腔液體。將抽吸的關節液以3 000 r/min離心20min，收集上清液，最后獲得關節液0.5 mY膝，將其注入試管內-20℃低溫冰箱保存。

1.6檢測方法

雙抗體ELISA法IL-1β、TNFα測定：采用ELISA雙抗體夾心法（按試劑盒說明書進行操作），取上述獲得的關節液200μl，確定所需的已包被兔IL-1β/TNFα抗體的酶標板孔數目，依次加入倍比稀釋的兔IL-1B/TNFα標準品和標本液，反應90min，自動洗板機洗滌2次，加入物素化兔IL-1β/TNFα抗體工作液，反應60min，洗滌3次，加入ABC工作液，反應30 min，洗滌5次，加人3，4，5-三甲氧基苯甲醛顯色工作液，避光反應，顯色后加入3，4，5-三甲氧基苯甲醛終止液。酶標儀在450 nm測定吸光度值，根據吸光度值計算樣品IL-1β/TNFα的濃度。

1.7統計學處理

數據處理應用SPSS 10.0軟件。治療組與對照組的比較應用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義，多組間兩兩比較應用q檢驗。

2結果

各組IL-Iβ、TNFα測定結果見表1。槲皮素組、塞來昔布組關節液中IL-1β、TNFα水平均較空白對照組低，差異具有統計學意義（P<0.01）；生理鹽水組關節液中的IL-1p、TNFa水平均與空白對照組差異無統計學意義（P>0.05）；槲皮素組模型關節液中IL-1β、TNFα水平均顯著高于塞來昔布組（P<0.05）。

3討論

筆者利用動物實驗的方法觀察了2種治療OA的藥物對OA模型關節液中細胞因子IL-1β、TNFα的影響。IL-1β與TNFα是非常重要的炎性細胞因子，多項研究表明OA關節中IL-1 β與TNFα水平明顯升高，IL-1β與TNF α是OA病理過程中重要的一環。Santangelo等研究發現OA時軟骨細胞和滑膜細胞分泌IL-1β明顯增加，并且對IL-1β的敏感性也顯著增加，同時增加的IL-1β可使軟骨細胞和滑膜細胞上調MMPs的表達，加劇炎癥反應，導致軟骨基質降解，并加速關節軟骨的破壞。IL-1可使滑膜細胞合成和分泌膠原酶和PGE2，刺激滑膜組織產生炎癥反應，加速軟骨基質的降解，最后導致關節軟骨的破壞。在OA患者滑液、滑膜組織、軟骨中IL-1β和TNFα呈高表達狀態。IL-1β和TNFα同時可促進大量的炎性和分解性因子分泌并產生放大級聯反應，促進關節軟骨的破壞，加速OA病情的發展。

實驗復制的大鼠膝骨關節炎模型，Hulth法建立兔OA模型具有創傷小，模型可重復性好，病理改變接近人類OA軟骨的病理改變的特點，造模4周時軟骨退變以粗糙糜爛等OA早中期改變為主。目前為學者廣泛從大體以及光鏡下觀察到關節充血、水腫、肥厚，關節液量增多，滑膜細胞增生活躍，且有明顯的炎細胞浸潤，軟骨表面有不同程度的糜爛、缺損，軟骨細胞排列紊亂，細胞減少。這些表現與骨關節炎的病理形態學變化相一致，說明模型復制成功。

實驗中槲皮素組、塞來昔布組關節液中IL-1B、TNFα水平均較空白對照組低于模型對照組，表明槲皮素、塞來昔布能夠阻止關節液中IL-1β、TNFα的產生，對IL-1β、TNFα的產生起到一定的抑制作用。塞來昔布是COX-2特異性抑制劑，屬于NSAID類藥物，NSAID藥物因能快速緩解骨關節炎癥狀而被大范圍使用，塞來昔布因具有較小的胃腸道不良反應被認為是治療OA的理想藥物，但是塞來昔布因為其胃腸道和心血管危險性，使其不能作為骨性關節炎的長期維持治療，所以臨床醫生一直尋找一種療效顯著，不良反應小、經濟的治療藥物，中醫藥正是具有以上優點。實驗結果表明OA動物模型經槲皮素與NSAID類藥物一樣也具有抑制患者關節炎癥的潛在作用。黃熹等認為槲皮素在這個體系中，具有顯著的抗氧化作用，能提高細胞的抗氧化能力，降低細胞的凋亡。槲皮素能明顯減少GS-NO損傷后的內皮細胞LDH的釋放，減少MDA的產生，提高SOD，GSH-PX的活性，抑制ROS的產生，抑制Caspase-3的激活，從而具有保護GS-NO誘導損傷的內皮細胞的作用，并且具有抗炎和組織保護作用。槲皮素可能是抑制了一氧化氮的表達，從而抑制了炎性因子IL-1β、TNFα的表達。這還需要實驗進一步去證實。

總之，實驗結果顯示早期應用槲皮素能與臨床上治療骨關節炎的常用藥塞來昔布產生類似的效果，能降低關節液IL-1 B和TNFα的水平，說明槲皮素能防治早期兔膝OA的形成，表明槲皮素可以考慮在目前臨床上用于治療骨關節炎。