西梅干預防大鼠草酸鈣腎結石的實驗研究

李 揚，張士青

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院泌尿外科,上海 201900)

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·基礎研究·

西梅干預防大鼠草酸鈣腎結石的實驗研究

李 揚，張士青

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院泌尿外科,上海 201900)

目的 研究西梅干對乙二醇誘導的大鼠草酸鈣腎結石形成的影響及其量效關系。方法 40只Wistar大鼠分為5組：A組空白對照組、B組為單純乙二醇誘石組、C～E組為西梅干干預組[分別灌喂西梅干勻漿2、4、8 mL/(kg·d)]，每組8只。除A組外，余皆用含1%乙二醇去離子水于大鼠自由飲用。于實驗前日和實驗第4周末，分別檢測大鼠尿鈣、鎂、草酸及枸櫞酸濃度；血鈣、鎂、肌酐和尿素氮濃度；腎臟組織丙二醛(MDA)含量及總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；偏光顯微鏡觀察HE染色腎臟組織草酸鈣結晶形成情況；TUNEL法檢測腎小管上皮細胞凋亡。結果 三種劑量的西梅干均能明顯減輕乙二醇所致的各項血尿生化指標和腎小管上皮細胞凋亡指數的改變，大幅增加尿鎂濃度，明顯減少乙二醇誘導的草酸鈣腎結石的生成。結論 三種劑量的西梅干均可明顯干預乙二醇誘導的大鼠草酸鈣腎結石的生成，且呈正相關的量效關系。

西梅干;乙二醇;自由基;腎損傷;草酸鈣腎結石

泌尿系結石絕大多數是草酸鈣腎結石，其發病機制復雜，研究表明，氧自由基和炎癥反應可導致腎小管損傷，從而吸附尿中草酸鈣結晶，長成結石[1]。

西梅是薔薇目李屬野生歐洲李(Prunus domestica L.)的法國栽培水果，后被引種到美國加州，作為不少人鐘愛的零食，西梅干進入我國則較早。由于最初進口時以為是西方來的梅子，故誤稱其西梅，其實它是李子(Plum)的一個分支。西梅富含纖維素、維生素A、維生素C、鉀、鐵、葉酸、鈣等，有明顯的潤腸通便作用，同時也富含抗氧化物質，含量高于藍莓、葡萄等，是果蔬中抗氧化能力最強的[2]。其主要抗氧化成分為酚類的新綠原酸(neochlorogenic Acid)和綠原酸(chlorogenic acid)，這兩種物質在體外具有超強的抗氧化作用[3-4]，但人體腸道對其吸收很少。西梅中還含有咖啡?？鼘幩峒霸ㄇ嗨氐途畚?，后者的抗氧化能力強于綠原酸[5]。西梅的抗氧化物質中還含有少量的黃酮類化合物和蘆丁，前者被證實具有抗炎作用。本實驗擬了解西梅干能否有效預防大鼠草酸鈣腎結石的形成，并探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 AR級乙二醇(Ethylene Glycol)購買于為上海長城華美儀器化劑有限公司，貨號為1000133；檢測腎臟細胞凋亡的DNA片段測定試劑盒購買于德同默克公司，貨號QIA13；

檢測氧化應激指標丙二醛(malondialdehyde，MDA)的試劑盒購買于南京建成生物工程研究所，貨號為A003-1；檢測總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase．T-SOD) 的試劑盒：購買于南京建成生物工程研究所，貨號為A001-1；西梅干為市售無核西梅干(Taylor Brothers FarmsTM，美國加州泰樂兄弟農場有限公司，無添加劑)。將西梅干和去離子水，按3∶1的質量比，放入九陽股份有限公司生產的九陽JYL-C012 料理機，16 000 r/min研磨5 min，制成西梅干勻漿，便于定量灌喂。

1.1.2 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠：購買于上海斯萊克實驗動物有限公司，生產許可證號為SCXK(滬)2012-00102，合格證編號：2007000561684。大鼠質量約為180 g，經適應性喂養1周后，再次測量質量為(188.2±4.4)g。

1.1.3 器械及儀器 DK-80電熱恒溫水浴箱購買于躍進醫療器械五廠；BeckmanLX200生化分析儀購買于美國Beckman公司；Fluko?FA25勻漿機購買于上海Fluko公司；AllegraTMX-12R離心機購買于美國Beckman公司；OLYMPUS IX51型倒置熒光顯微鏡購買于奧林巴斯(中國)有限公司；磁力攪拌器購買于上海同樂儀器有限公司；DXL-10實驗大鼠代謝籠購買于蘇州市標正電器有限公司；九陽JYL-C012料理機購買于九陽股份有限公司；FA1104分析天平購買于上海天平儀器廠； SmartSpeeTM Plus分光光度計購買于美國BioRad公司。

1.2 動物分組及實驗設計 40只Wistar大鼠隨機分為8組：A為空白對照組、B為單純乙二醇誘石組、C～E 為西梅干干預組[分別灌喂西梅干勻漿2、4、8 mL/(kg·d)]，每組8只。除B組外，余皆用含1%乙二醇去離子水作為大鼠的唯一飲用水源并自由飲用，以誘導生成草酸鈣腎結石。中、小劑量干預組的西梅干勻漿均用去離子水配置成8 mL/(kg·d·只)的灌喂量；空白對照組及單純誘石組給予去離子水8 mL/(kg·d·只)灌喂。持續4周。

1.3 觀察與檢測

1.3.1 動物情況觀察 實驗開始日測量各組大鼠的體重；每天計量大鼠的飲水和飲食量；每周末測量各組大鼠的體重。統計飲水量、飲食量和體重，同時觀察動物是否出現腹瀉及死亡等異常情況。

1.3.2 檢測血、尿生化指標 將適應性飼養1周的空白組大鼠(實驗開始前日)以及實驗結束時(4周末)的所有大鼠放入清潔代謝籠中，收集所有大鼠24 h尿液，并抽取全血樣本。應用Beckman LX200生化分析儀檢測大鼠血、尿離子鈣和鎂濃度，血清肌酐(serum creatinine， SCr)和血尿素氮(blood urea nitrogen， BUN)濃度；用鉻酸鉀氧化甲基紅催化光度法[6]測定尿草酸濃度，用五溴丙酮硫脲比色法[7]測定尿枸櫞酸濃度。

1.3.3 腎臟組織相關檢測 連續灌喂4周后，在留取血、尿樣本后，處死所有大鼠，留取雙側腎臟，并稱重。把左腎制成石蠟切片，一部分切片經蘇木精-伊紅染色法(HE染色)在偏光顯微鏡下觀察結晶形成情況，并計算結晶評分[8]；另一部分切片進行免疫組化細胞凋亡染色(TUNEL法)后，在熒光顯微鏡下觀察腎小管上皮細胞凋亡情況。每一張切片至少計500個細胞，并計算陽性細胞數，凋亡細胞為藍棕色核，以百分數表示凋亡指數。

將右側腎臟制作成組織勻漿，分別檢測MDA含量、T-SOD活性，了解大鼠體內氧化應激及自由基變化情況。

2 結 果

2.1 動物情況 各組大鼠在灌喂期間均未出現死亡情況。E組大鼠在灌喂第16天開始出現腹瀉。A組大鼠毛色光滑，精神好，活動多；B組大鼠毛色亮度差，消瘦，精神差，活動少。單純誘石組大鼠的尿量和飲水量均比空白對照組顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；各干預組的尿量和飲水量的增幅均有所減少(呈負相關的量效關系)具體見表1、表2。

2.2 血、尿生化指標

2.2.1 尿生化指標 尿草酸、枸櫞酸、離子鈣濃度：單純誘石組和各干預組大鼠的尿草酸和尿離子鈣濃度均顯著高于A組(P<0.05)，但各干預組大鼠的尿離子鈣濃度、尿草酸和尿枸櫞酸濃度均顯著低于B組(P<0.05)。B組大鼠的尿鎂濃度顯著低于A組，且差異有統計學意義(P<0.05)；而各干預組尿鎂濃度顯著高于A組及B組，分別為4.24、4.76、5.23倍及5.80、6.51、7.15倍，且差異均有統計學意義(P<0.05，表3)。

分組體重(g)實驗開始時實驗結束時A188.62±4.58319.53±3.71B188.87±4.21313.98±3.68C187.35±6.48308.49±6.44D190.84±4.45312.44±3.82E185.68±4.13311.35±6.43

組別飲水量尿量實驗前日(基線)120.85±2.487.56±0.75A129.12±5.279.98±1.79B189.54±8.32*17.46±0.52*C153.56±7.8213.19±0.71D130.15±7.9213.06±0.77E128.35±7.6711.31±0.53

實驗前日基線資料為空白對照組大鼠實驗開始前的相關指標的檢測結果；與 A組相比，*P<0.05；飲水量、尿量為4周均量。

組別尿離子鈣尿鎂離子尿草酸尿枸櫞酸實驗前日(基線)2.29±0.189.19±0.351.52±0.329.89±0.08A3.06±0.259.48±0.331.39±0.1010.26±0.06B4.98±0.05*6.94±0.12*3.64±0.52*8.60±0.16*C4.58±0.10*#40.24±0.74*#3.11±0.23*#9.61±0.39*#D4.01±0.11*#45.16±0.75*#2.24±0.05*#■9.96±0.12*#■E3.94±0.09*49.61±0.65*#1.61±0.13*#9.99±0.09*#

實驗前日基線資料為空白對照組大鼠實驗開始前的相關指標的檢測結果；與空白對照組比較，*P<0.05；與單純誘石組比較，#P<0.05； 與C組比較，■P<0.05。

2.2.2 血生化指標 B組肌酐(Scr)較A組升高了109.19%，而各干預組的增幅低了不少，僅分別比A組增高了55.94%、25.29%、8.43%，量效關系顯著，并明顯低于B組(P<0.05)，但組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。各組血鈣濃度與血鎂濃度的差異無統計學意義(P>0.05)。與A組比較，B組大鼠血尿素氮(BUN)升高了23.97%，差異有統計學意義(P<0.05)，各干預組的BUN則介于A組及B組之間，差異有統計學意義(P<0.05,表4)。

組別血鈣血鎂血肌酐血尿素氮實驗前日(基線)2.47±0.122.38±0.2833.68±2.386.42±0.87A2.58±0.062.44±0.2332.63±3.206.34±0.56B2.92±0.03*1.42±0.2968.25±1.39*7.86±0.38*C2.84±0.08#1.76±0.1950.88±7.34*#6.86±0.89*#D2.74±0.10#1.81±0.3340.88±5.17#■6.31±1.02*#■E2.69±0.13#2.02±0.53*35.38±7.27*#6.36±0.57*

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；③與C組比較，■P<0.05。

2.3 腎臟組織相關檢測指標比較

2.3.1 腎臟質量 處死各組大鼠，取腎臟稱質量，各組大鼠腎臟質量分別為(0.967±0.11)、(1.355±0.05)、(1.285±0.39)、(0.902±0.35)、(0.906±0.14)g，組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.3.2 大鼠腎臟組織草酸鈣結晶形成情況 利用200倍偏光顯微鏡觀察HE染色切片發現(圖1)：A組大鼠光鏡下可見腎小管結構正常，并未見明顯的草酸鈣腎結晶；B組大鼠腎臟組織中草酸鈣結晶呈片狀連接，在腎皮質、髓質及乳頭均可見到，結晶總評分達31分。3個西梅干干預組大鼠腎臟組織結晶評分分別為18分、13分、10分，比B組的結晶評分分別降低了41.94%、58.06%、67.74%。各干預組組間比較差異無統計學意義(P>0.05,表5)。

圖1 各組大鼠腎臟組織草酸鈣結晶形成情況(HE，×200)

表5 各組大鼠腎臟組織結晶評分

組別結晶分級0ⅠⅡⅢⅣ總得分比B組降低(%)A3200000B061012431-C3911811941.94D51110601658.06E8128401167.74

2.3.3 各組大鼠腎臟組織中MDA含量和T-SOD活性 與A組比較，B組大鼠腎臟組織中MDA含量明顯增加，而T-SOD活性顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。各干預組的MDA增幅和T-SOD活性降幅均顯著低于B組，差異均有統計學意義(P<0.05)，干預效果與干預劑量有明顯的量效關系，見表6。2.3.4 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡指數 B組比A照組高14.5倍，各干預組的增幅顯著低于單純誘石組(P<0.05)，并呈量效關系，見圖2、表7。

2.3.5 大鼠腎臟結晶評分與各組參數的相關性比較

相關性分析顯示，大鼠腎臟結晶評分與大鼠尿液中鎂離子濃度、腎臟組織內SOD水平存在顯著相關性，

回歸分析得到的回歸方程為：Y=38.181-0.306Mg-0.084SOD。各個劑量組組間相關性比較均無統計學意義，見表8。

組別MDA(nmol/mgprot)T-SOD(U/mgprot)A2.58±0.08250.99±2.66B6.70±0.19*107.56±4.09*C5.36±0.45*#186.14±6.16*D4.63±0.46*#■174.35±9.17*#■E3.75±0.47*#126.02±12.46*#

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，■P<0.05;mgprot即mg組織。

表7 各組大鼠腎組織凋亡指數

組別凋亡指數(%)凋亡指數相對值(與B組比)A4.6250.157B29.389*1.000C16.073*#0.547D14.654*#0.499E12.299*#■0.418

與空白對照組比較，*P<0.05；與單純誘石組比較，#P<0.05；與C組比較，■P<0.05。

表8 大鼠腎臟結晶評分與各組參數的相關性比較

參數非標準化系數回歸系數標準誤差標準化系數試用版t值P值腎臟結晶評分38.18129.1910.9750.334尿鈣(mmol/L)7.0953.8400.4821.8480.070尿鎂(mmol/L)-0.3060.069-0.808-6.2100.000血鈣(mmol/L)4.8928.6370.0740.5660.574血鎂(mmol/L)0.0361.9190.0020.0190.985T-SOD(nmol/mgprot)-0.0850.021-0.426-4.4170.000MDA(U/mgprot)-1.1321.642-0.166-0.6900.493尿枸櫞酸(mmol/L)-2.2512.171-0.147-1.0370.305尿草酸(mmol/L)-1.3702.114-0.126-0.6480.520腎細胞凋亡指數-0.2560.164-0.194-1.5560.125血肌酐(mmol/L)-0.2300.122-0.320-1.8780.066血尿素氮(mmol/L)0.9540.6490.1311.4680.148

mgprot即mg組織。

圖2 各組大鼠腎臟腎小管上皮細胞凋亡情況(TUNEL，×200)

3 討 論

國內外學者對泌尿系結石的形成原因進行了大量的研究，對其基本機制的了解也日益深入。目前已知，腎臟病理改變，特別是腎小管上皮細胞的損害，是尿石形成的最早期的基礎病變[9]，多種因素引起的腎小管上皮細胞損傷的主要機制是自由基的介導。

自由基廣泛存在于自然界，存在于生物體內的是氧自由基，又稱活性氧(reactive oxygen species，ROS)，主要包括過氧化氫、超氧化物以及羥基陰離子。正常情況下的ROS的產生是受到嚴密調控的，只有在被需要時才增加。ROS的過量生成或體內抗氧化劑水平的降低，將導致氧化應激(oxidative stress,OS)、炎癥和損傷，并參與了結石的生成[10]。

研究發現，腎小管上皮細胞在損傷因素的作用下，細胞內會產生大量的ROS[11]，而ROS可導致腎近端小管上皮細胞功能損傷[12]。LEE等[13]發現草酸在一定程度上可以通過ROS損傷腎臟上皮細胞。MAHMUD等[14]用抗氧化劑N-乙酰L-半胱氨酸(N-acetyl l-cysteine,NAG)可抑制甲基多巴所致的紅細胞氧化應激反應，并抑制甲基多巴引起的紅細胞膜磷脂酰絲氨酸(Phosphatidyl serine,PS)外翻過程。XU等[15]研究發現細胞內活性氧水平升高可以引起細胞內鈣離子水平的升高，而添加抗氧化劑可降低鈣離子濃度。GRASES等[16]體外模擬腎臟條件，證明了自由基可引起腎臟上皮細胞損傷，并形成一個有利于結晶形成的環境；應用抗氧化劑可抑制草酸鈣結晶的生成。國內外學者通過對草酸鈣結石患者的臨床研究，也證實了ROS在腎結石的形成中發揮著重要的作用。張越等[17]檢測了30例健康無結石志愿者和40例腎結石患者，發現腎結石患者尿酶NAG、β2-MG和r-GT顯著升高，表明尿路結石伴有腎小管功能損傷；而其血清TNF-α、血漿MDA值升高，血漿SOD活性降低，表明炎癥反應和自由基參與了腎結石患者的腎小管損傷過程，并且很可能是腎結石復發的重要原因。WIPAWEE等[18]通過對腎結石附近腎乳頭活檢發現細胞DNA氧化應激增加了，支持腎小管上皮細胞的損傷是由氧化應激引起的。

西梅富含纖維素、維生素A、維生素C、鉀、鐵、葉酸、鈣等，有明顯的潤腸通便作用。除了作為新鮮水果食用外，市場上最多見的還是飲料西梅汁和果脯西梅干(Dried plums，Prune)。

西梅富含抗氧化物質，含量高于藍莓、葡萄等，是果蔬中抗氧化能力最強的[2]。其主要抗氧化成分為酚類的新綠原酸(neochlorogenic acid)和綠原酸(chlorogenic acid)，這兩種物質在體外具有超強的抗氧化作用[3、4]，但人體腸道對其吸收很少。西梅中還含有咖啡?？鼘幩峒霸ㄇ嗨氐途畚?，后者的抗氧化能力強于綠原酸[5]。西梅的抗氧化物質中還含有少量的黃酮類化合物和蘆丁，前者被證實具有抗炎作用。楊艷等[19]發現，攝入適量的西梅汁，可以通過顯著升高小鼠血清SOD、抑制GSH-Px活性，有效增強老齡小鼠體內的抗氧化能力。

西梅經加熱脫水制成西梅干后，具有抗氧化作用的酚類含量損失過半(其中新綠原酸含量不變，綠原酸輕度減少)，但抗氧化能力卻反而大大增強，且增幅與加熱溫度成正比。研究發現，在西梅干的熱加工過程中，糖與有機酸之間發生的非酶促褐變(美拉德反應)，會產生一些具有較強抗氧化能力的美拉德反應物(maillard reaction products,MRPs)，其中，羥甲基糠(hydroxymethylfural，HMF)含量與西梅干的抗氧化活力具有較好的相關性[20]。蛋白黑素也是一種MRPs，具有抗氧化能力、降壓能力和金屬結合能力[21]。POSADINO等[22]研究表明，西梅干的蛋白黑素可以保護血管內皮細胞免受氧化應激損傷。

本實驗發現，西梅干能夠大幅度增加尿鎂濃度，其原因并非西梅富含鎂元素，因為本實驗所用西梅干的鎂含量并不高，僅為45 mg/100 g。鑒于其血鎂水平低于空白對照組，故推測其增加尿鎂排泄量的機制可能為減少了尿鎂的重吸收。

尿枸櫞酸是腎結石生成的抑制因子之一。本實驗發現，西梅干能夠明顯抑制乙二醇誘導的大鼠尿枸櫞酸濃度降低，其機理不明。

由于乙二醇的水溶性較強，西梅對其吸收不會有明顯影響，因此，西梅能明顯抑制乙二醇誘導的大鼠高草酸尿癥，其機理可能為抑制了內源性草酸的生成或抑制了乙二醇轉化成草酸。

本實驗結果顯示，單純誘石組大鼠的SCr、BUN濃度比空白對照組明顯增高，而西梅干能明顯降低這些增幅，說明西梅干具有一定的保護大鼠腎功能的作用，其機理不明。

與單純造模組相比，各西梅干干預組24 h尿草酸及尿鈣排泄量明顯減少，腎臟水腫較輕，草酸鈣結晶少，腎上皮細胞凋亡指數減少，說明西梅干能減少尿草酸及尿鈣排出，從而抑制草酸鈣結晶的形成。干預組腎組織MDA含量明顯低于誘石組，SOD活力明顯高于誘石組，表明西梅能夠清除氧自由基,保護腎小管上皮細胞，從而減少草酸鈣結晶的沉積，預防腎結石生成。本實驗得出大鼠腎臟結晶評分與大鼠尿液中鎂離子濃度、大鼠腎臟組織SOD水平存在顯著負相關，這也從側面證實了西梅能夠通過增加大鼠尿液中鎂離子濃度及腎臟組織中SOD水平來預防結石。

綜上所述，西梅干能夠明顯地抑制大鼠草酸鈣腎結石的形成，其效果呈劑量依賴性，其作用機理包括對抗自由基、減輕腎損傷、降低尿鈣和尿草酸、增加尿枸櫞酸和尿鎂濃度等。從“藥食同源”的角度看，患者可以食用西梅干來預防泌尿系結石。

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(編輯 王 瑋)

Effects of prune intervention on calcium oxalate nephrolithiasis in rats

LI Yang, ZHANG Shi-qing

(Department of Urology, 9th People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University, Shanghai 201900, China)

Objective To investigate the effects of prune intervention on ethylene glycol-induced calcium oxalate nephrolithiasis in rats and its dose-effect relationship. Methods A total of 40 Wistar rats were divided into 5 groups:blank control group (group A), ethylene glycol-induced calcium oxalate group (group B), 2 mL/(kg·d) original homogenate of prune group (group C), 4 mL/(kg·d) original homogenate of prune group (group D), 8 mL/(kg·d) original homogenate of prune group (group D), with 8 rats in each group. Except for group A, the other groups were given 1% glycol deionized water to drink freely. Before and 4-week after the experiment, serum and urine concentrations of ionized calcium, magnesium, oxalic acid, and citric acid; blood concentrations of calcium, magnesium and creatinine were measured. After rats were sacrificed and renal tissues were obtained, the content of malondialdehyde (MDA) and activity of total superoxide dismutase (T-SOD) in renal tissues were determined. The formation of calcium oxalate crystals in renal tissues was observed with HE staining, and the apoptosis of renal tubular epithelial cells was detected by TUNEL method. Results All of the three doses of prune could significantly reduce the change of biochemical index in blood and urine, and the renal tubular epithelial cell apoptosis index; increase the urinary magnesium concentrations; significantly reduce the calcium oxalate kidney stone formation in rats induced by ethylene glycol. Conclusions All of the three doses of prune can inhibit ethylene glycol-induced calcium oxalate nephrolithiasis in rats and there is a positive correlation between dose and effect.

prune; ethylene glycol; free radicals; kidney injury; calcium oxalate stones

2016-03-11

2016-08-01

張士青，主任醫師，教授.E-mail:uclazsq@163.com

李揚(1988-)，男(漢族)，住院醫生，研究生，研究方向：泌尿系結石.E-mail：15821477378@163.com

R692.4

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.11.015