‘金凱特’杏的組織培養與快繁

孫清榮+王金政+薛曉敏+孫洪雁

摘 要：為了建立杏新品種 ‘金凱特（Prunus armeniaca Lam.）的組織培養快繁技術體系，以其當年生半木質化綠枝莖段為材料，研究了基本培養基、外源植物生長物質及蔗糖濃度對腋芽啟動、試管苗繼代增殖及生根的影響。結果表明，腋芽啟動培養時，MS培養基較QL培養基更有利于腋芽的萌發生長，在添加1.0 mg/L BA和0.2 mg/L IBA的MS培養基上，腋芽萌發率達85.8%。試管苗的繼代增殖培養基以WPM最佳，其次為MS，QL最差。生根培養基以MS最有效，1/2MS和1/2QL均不能誘導根的產生；蔗糖濃度20 g/L比30 g/L顯著提高了生根率；最佳生根培養基為MS + 2 mg/L IBA + 20 g/L蔗糖，生根率為93.2%，平均每株生根數為2.5。

關鍵詞：金凱特杏；組織培養與快繁；腋芽啟動；增殖；生根誘導

中圖分類號：S662.204+.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）12-0025-04

Abstract In order to establish the technological system of tissue culture and rapid proliferation of apricot new variety ‘Jinkaite （Prunus armeniaca Lam.）， the current half-lignified branches were selected as materials to study the effects of basal media， plant growth regulators and sucrose concentrations on axillary bud initiation， in vitro shoots proliferation and rooting were examined. The results showed that the basal medium MS was more effective than QL for axillary bud initiation and growth. The highest germination rate of axillary bud was obtained on the MS with 1.0 mg/L BA and 0.2 mg/L IBA， which reached 85.8%. For proliferation， the basal medium WPM was the best followed by MS， and QL was the poorest. For rooting， MS was the most effective， and 1/2MS and 1/2QL failed to induce rooting. The concentration of sucrose as 20 g/L significantly improved the rooting rate compared to 30 g/L. The optimal rooting medium was MS + 2 mg/L IBA + 20 g/L sucrose with the rooting rate as 93.2%， and the average root number per plantlet was 2.5.

Keywords ‘Jinkaite Apricot； Tissue culture and rapid proliferation； Axillary bud initiation； Proliferation； Root induction

杏（Prunus armeniaca Lam.）果實含有豐富的蛋白質、礦物質元素、維生素和氨基酸，是一種營養價值較高的水果，深受人們喜愛。但大多數杏栽培品種經常受到由細菌、真菌及病毒等引起的病害威脅[1-4]。病毒病會造成果樹生長勢衰弱，產量降低，果實品質下降，嚴重時會導致樹體枯死[5]。培育無病毒（嚴格說應是無特種病毒）種苗是防治病毒病害的最有效措施。無病毒種苗的生產與保存，是現代果業生產優質苗木的基礎。組織培養方法脫除果樹病毒已在國內外得到了廣泛應用[5]。因此，以無性繁殖方式進行果樹種苗繁育，成功建立其組織培養快繁技術體系，是進行良種苗木脫毒研究及無病毒苗木培育的基礎，也是實現良種苗木快繁及無病毒苗工廠化育苗的基礎。杏樹組培快繁技術體系的建立，對優特異種質資源的離體保存及利用現代生物技術育種方法改良品種都具有重要的現實意義。

果樹的組織培養研究中，桃、杏、李等核果類果樹落后于蘋果、梨等仁果類果樹，被認為是組織培養較困難的種類之一。有關杏的組織培養已有成功的報道[6，7]，但都存在繁殖系數低或生根率低的問題，且不同基因型的適宜組培條件存在差異?！饎P特杏是山東省果樹研究所從‘凱特杏的自然雜交實生種中選出的早熟優良新品種[8]。該品種具有早熟、果大、優質、耐貯及自花結實等特點，具有較高的商業生產價值。本試驗建立了‘金凱特杏組培快繁技術體系，以期為該優良品種的病毒脫除、無病毒苗木的生產及利用生物技術進行品種改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

山東省果樹研究所苗圃種植的‘金凱特杏成年大樹。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得 2012年5月，從成年大樹上剪取健壯無病蟲害的半木質化枝條，去掉葉片后剪成一芽一段的芽段。將芽段用洗衣粉水清洗后，自來水流水沖洗30 min以上，置于超凈工作臺上的無菌燒杯中，先用70%酒精殺菌1 min，再用5%次氯酸鈉溶液殺菌8 min，期間搖動5～8次，最后用無菌水洗4～5次，接種到裝有芽啟動培養基的三角瓶內。

芽啟動培養基為分別添加1.0 mg/L BA和0.2 mg/L IBA的MS、QL和WPM培養基。所有培養基均添加3%蔗糖和0.6%瓊脂，滅菌前調pH值5.8。每種培養基接種10瓶，每瓶接種4個外植體。接種后置于光周期為16 h/8 h （光/暗）、培養溫度為（25±2）℃的培養室培養。培養4周時統計腋芽萌發率（腋芽萌發芽段數/接種總芽段數×100%）。腋芽萌發并伸長生長形成的綠梢用作增殖試驗的材料。

1.2.2 無菌苗的增殖 腋芽萌發獲得無菌苗后，轉移到增殖培養基進行增殖培養。

試驗1：共設3個增殖培養基處理，基本培養基為QL、1/2MS及1/2QL+1/2MS，分別添加1.0 mg/L BA和0.1mg/L IBA。

試驗2：將試驗1獲得的無菌苗用做本試驗繼代增殖的材料?；九囵B基為MS、QL和WPM，分別添加0.5 mg/L BA、0.05 mg/L IBA和0.5 mg/L GA3，共3個處理。每處理接種5瓶，每瓶接種5個外植體。每4周繼代一次并記錄外植體的新增梢數，共繼代培養3次，取其平均值作為每個處理每個繼代周期的增殖梢數。重復2次。

1.2.3 無菌苗生根誘導 將增殖培養基上1.5 cm以上的健壯綠梢轉移至生根培養基進行生根誘導。生根培養基為添加1 mg/L IBA和20 g/L蔗糖的1/2QL和1/2MS培養基及分別添加1、2 mg/L IBA及20、30 g/L蔗糖的MS培養基，共6個處理（見表2）。接種后暗培養1周，轉移至光照條件下培養，光周期為16 h/8 h（光/暗）。培養4周時統計生根株數及每株根數，計算生根率和平均每株根數。生根率（%）=生根梢數/接種總梢數×100；平均每株根數=生根植株的總根數/生根植株數。

1.3 數據處理

試驗數據采用DPS v 3.01軟件進行統計分析，不同處理平均值采用LSD法進行顯著性差異比較分析。

2 結果與分析

2.1 無菌苗的獲得

三種啟動培養基均可誘導芽段的腋芽萌發（圖1A），但不同培養基上的萌發率不同，MS培養基上萌發率最高，達85.8%；其次為QL培養基，為50.1%；WPM培養基最低，僅為29.8%（資料沒有列出）。表明MS基本培養基誘導‘金凱特杏半木質化莖段上的腋芽萌發最有效。

2.2 無菌苗的增殖

試驗1的三種不同培養基處理均有芽的增殖，但均表現為芽的伸長生長很差或不伸長（圖1B、C和D）。表明這三種培養基均不適宜于‘金凱特杏無菌苗的增殖培養。

試驗2的不同培養基處理上均獲得了伸長生長的綠梢，且各處理均明顯優于試驗1，但不同培養基上的增殖倍數和伸長梢的生長情況不同。由表1可見，基本培養基為MS和WPM的處理平均增殖梢差異不顯著，但顯著高于QL培養基處理。由圖1可以看出，WPM培養基上產生的有效梢最多，長勢最壯，葉綠且大，沒有枯頂現象（圖1E）；其次為MS培養基（圖1G、H）；QL培養基最差（圖1I），產生的有效梢較少，且有枯頂現象發生（圖1J）。表明WPM培養基是‘金凱特杏增殖快繁及新梢生長的最適宜培養基。但WPM培養基上的新梢培養時間過長（6周以上）時，會出現黃化或白化現象（圖1F）。因此‘金凱特杏繼代增殖培養時，較宜選用WPM+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L IBA+0.5 mg/L GA3培養基，繼代周期時長應控制在6周以內。

2.3 無菌苗生根

由表2可見，添加不同濃度IBA和蔗糖的MS培養基均可誘導‘金凱特杏新梢生根，但四種不同MS培養基上生根率差異顯著。其中，MS+2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖培養基上的新梢生根率最高，顯著高于其它處理；其新梢平均生根數也最高，與MS+1 mg/L IBA+20 g/L蔗糖和MS+2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖培養基差異不顯著，但顯著高于MS+2 mg/L IBA+30 g/L蔗糖培養基。而添加1 mg/L IBA和20 g/L蔗糖的1/2MS和1/2QL培養基均不能誘導‘金凱特杏新梢生根。從根的生長情況來看，高濃度的IBA（2 mg/L）較低濃度的IBA（1 mg/L）更易誘導產生愈傷組織（圖1K和L）。綜合分析可得，‘金凱特杏試管苗最適宜的生根培養基為MS+2 mg/L IBA+20 g/L，培養時間控制在5周以內，防止根上過多產生愈傷組織。

3 討論和結論

以半木質化綠枝芽段為外植體進行無菌苗的啟動培養，是多年生木本植物獲得無菌苗的一種行之有效的方法[5-7]，但啟動培養適宜的培養基條件因基因型不同而不同。研究表明，‘龍王帽和‘紅荷包杏啟動培養的適宜基本培養基均為MS培養基[6，12]，但添加的外源植物生長物質不同，前者為0.5 mg/L BA和0.2 mg/L IBA，后者為0.25 mg/L BA和0.01 mg/L IBA。而‘Bebecou 杏啟動培養的適宜基本培養基為Balla培養基[13]。本研究中 ‘金凱特杏的啟動培養基以添加1.0 mg/L BA和0.2 mg/L IBA的MS培養基效果最佳，腋芽萌發率最高，但所添加的植物生長調節物質不同。表明基因型不同的相似外植體，其適宜的啟動培養基也不同。

基本培養基的組成對試管苗的增殖具有重要影響。不同品種杏的適宜增殖培養的基本培養基組成不同。品種‘El-Hamawey在WPM上獲得了良好的增殖和伸長生長[14]；品種‘Currot、‘Helena和‘Lorna在QL培養基上增殖和伸長生長最佳[15]；品種‘龍王帽在NN69培養基上的增殖和伸長生長最佳[6]。本研究中‘金凱特杏試管苗的適宜增殖培養基為WPM，在該培養基上既可獲得較高的增殖效率，又可獲得較高的有效梢數（可用于生根的伸長梢數）。但在WPM上的繼代培養時間應控制在6周以內，以防黃化或白化苗的發生。

生根誘導是組培快繁的一個重要步驟。生根難或生根率低是組培快繁的一個重要障礙。本研究中利用全量MS添加2 mg/L IBA誘導‘金凱特杏獲得了較高的生根率（93.2%），這與前人報道的1/2或1/3基本培養基可提高生根率的結果不同[6，13]，而與‘Helena杏用全量QL比1/3QL更有利于生根的結果相似[15]。本研究中雖然較高濃度IBA（2 mg/L）比較低濃度（1 mg/L）更有利于提高生根率，但隨著生根誘導培養時間的增加，較高濃度IBA上產生的根易產生愈傷，較多的愈傷會影響移栽成活率。因此生根培養時間控制在5周以內，可誘導‘金凱特杏達到理想的生根效果。

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