紫杉酚納米纖維對腫瘤生長和新陳代謝的抑制作用

李翔

摘要：水凝膠分子在藥物靶向制劑方面具有廣闊的應用前景。為此，主要對常用抗癌藥紫杉酚制備水凝膠分子進行研究。將紫杉酚衍生物（Taxol-SAGSSG，化合物1）制成水凝膠，注入固體腫瘤，可顯著抑制腫瘤生長，阻止新陳代謝。通過靜脈注射紫杉酚，可以提高抗癌效果；血液中的紫杉酚濃度較低，可提高小鼠對紫杉酚的耐藥性，減少化療過程中的副作用。

關鍵詞：紫杉酚納米纖維；水凝膠；抑制

中圖分類號：TB

文獻標識碼：A

doi：10.19311/j.cnki.1672.3198.2016.28.104

1 引言

采用臨床用紫杉酚制備水凝膠。為克服化療期間抗癌藥物的缺點（低水溶性和系統毒性），對藥物載體進行了大量研究，藥物載體可以增加抗癌藥（如：紫杉酚、喜樹堿和阿霉素）的水溶性，靶向給藥于癌細胞。聚合物水凝膠、納米藥物載體已得到廣泛應用，如脂質體、DNA、共聚物，自組裝的分子水凝膠在用作疏水性抗癌藥的靶向給藥系統方面具有很大的潛力。

盡管分子水凝膠已經在抗癌藥給藥系統領域得到廣泛應用，但制備時間長、成本高。FDA認可的分子水凝膠給藥系統中，只有兩種是未經化學修飾，由藥劑本身形成的。由藥劑本身形成的分子水凝膠給藥系統具有更廣闊的應用前景。本文主要研究紫杉酚水凝膠，用于瘤內給藥，提高抗癌效果，降低系統毒性。

2 材料和方法

2.1 制備水凝膠

在37℃條件下，將20mg的化合物1和2.2當量的Na2CO3溶解于1.0mLPBS緩沖溶液（pH=7.4）中，放置12h制得膠體。

2.2 分析制備水凝膠時的水解過程

在不同時點，取20mL上述濃度的溶液，加入200mL甲醇，然后取一定量清液進行液質色譜分析，通過液質色譜的峰面積測定Taxol-SA-GSSG水解后的成分。

2.3 水凝膠體外釋放紫杉酚規律

0.25mL的凝膠（在37℃條件下，放置4天形成1.0wt%，1.5wt%，和2.0wt%的凝膠），分別用0.25mL新鮮的PBS緩沖溶液（pH7.4）進行滴定。每隔一段時間，取出0.2mL上述溶液和對照溶液進行LC-MS檢測，通過液質光譜峰的面積來測定凝膠釋放紫杉酚的百分含量，每組進行4次平行實驗。

2.4 體內藥物毒性

在小鼠右翼注射一定量的水凝膠，每隔一天計算一次小鼠的相對體重。計算公式：相對體重=體重/原體重*100%。

2.5 藥代動力學分析

在年齡、性別相當的小鼠右翼，分別注射50μL三種劑量的水凝膠（10、20、40mg/kg）PBS溶液，在指定時間內抽取血樣，對照組經過同樣的方法處理。在指定時間間隔內，收集500μL血樣放入肝素化管中。離心10min后制得血漿樣品，通過液萃取，將紫杉酚從血漿中分離出來，測算藥物動力學參數。

2.6 體外評估抗腫瘤效果

EL-4細胞和4T1-熒光素酶細胞均在實驗室保存。注射2×105EL-4細胞的小鼠作為淋巴瘤的動物模型；在乳房脂肪墊中注射2×1054T1-熒光素酶細胞的雌性小鼠，作為乳腺腫瘤的動物模型；每隔一天測算一次腫瘤的體重，通過公式來計算腫瘤體積：長×寬×（長+寬）/2。當腫瘤體積達到500mm3時，將小鼠隨機分組，包括：（1）淋巴瘤動物模型：10mg/kg*2紫杉酚；乳腺腫瘤的動物模型：10mg/kg*4TaxolR；從0天起，在規定的時間內，每隔一天注射一次TaxolR；（2）瘤內注射50mL10mg/kg，20mg/kg和40mg/kg的水凝膠；（3）瘤內注射PBS緩沖溶液作為對照組；給藥當日記為0天。小鼠在接受治療后的體重，記作相對重量（%）。

3 結果與討論

3.1 分子設計與水凝膠形成過程

紫杉酚衍生物經過酯鍵水解，釋放出紫杉酚分子，從而形成分子水凝膠。設計的化合物1Taxol-SA-GSSG具有以下優勢：（1）丁二酸（SA）和氧化谷胱甘肽（GSSG），可用于活的有機體內；（2）GSSG具有較強的親水性，可以提高化合物1的水溶性；（3）GSSG市場上有賣，使化合物1的合成簡單易行。因此可用作分子凝膠因子（紫杉酚）的前體。

在室溫（22～25℃）或37℃下，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4），制備含有2.0wt%的化合物1溶液，用于測定凝膠性能。在室溫和37℃條件下，6小時后，觀察水凝膠的形成過程。LC-MS檢測結果顯示，在凝膠點、4天后和7天后，紫杉酚和SA分別自組裝形成57%，90%和95.4%的酯鍵。酯鍵的水解速度，主要依賴于溶液的pH值，pH值越高越容易，反之亦然。溶液的pH值不高于8.0，此外，紫杉酚上的酯鍵也可以被水解。水凝膠在室溫或在4℃時，可以穩定存在，在PBS緩沖溶液（pH7.4）的水凝膠，在室溫下可保存3個月，酯鍵沒有發生任何水解?；衔?和PBS緩沖溶液水解過程的濃度范圍0.5～15.0wt%（低于0.5wt%一周后溶液澄清，化合物1在緩沖溶液中濃度為15wt%時最穩定）。紫杉酚水凝膠只能通過水解過程形成，加熱-冷卻或借助有機溶劑都不能制得。實驗結果表明，紫杉酚可以通過水解過程形成水凝膠，在形成的水凝膠中紫杉酚濃度范圍較大。

3.2 血流計

采用血流計表征水凝膠的機械性能，測試水凝膠能否注射。血流計在含有2wt%化合物1的PBS溶液中靜止24h后，進行動態頻率掃描。用注射器吸入凝膠，然后注入到小瓶中，5分鐘后，會再形成凝膠。結果顯示，形成的紫杉酚水凝膠可用于動物皮下組織注射。

3.3 納米纖維形態學

可以通過掃描電鏡（TEM）觀察到寬約25nm、長約幾個微米的納米纖維。這些納米纖維組成三維網狀結構，形成水凝膠。

3.4 體外釋放

在生理溫度37℃條件下，研究紫杉酚凝膠的體外釋放過程。將0.25mL的PBS緩沖溶液滴加到0.25mL含有不同濃度化合物1（原濃度=1.0，1.5和2.0wt%）的凝膠中。在預定時間點，取出適量溶液用于檢測凝膠中累計釋放紫杉酚的量，再加入0.25mL新鮮的PBS緩沖溶液。結果表明含有不同濃度的紫杉酚凝膠具有相似的釋放特性。在剛開始的8小時，均以每小時1.4mg的速度釋放，在隨后的16小時里，以每小時0.75mg的速度釋放。

3.5 最小致命劑量

單次注射紫杉酚的劑量不超過20mg/kg，會對小鼠造成嚴重毒性，小鼠恢復正常行動至少需要24小時。單次注射紫杉酚的劑量為40mg/kg時，對小鼠是致命的，因此臨床注射紫杉酚的致命劑量在20～40mg/kg之間。與紫杉酚相比，紫杉酚水凝膠在小鼠體內毒性較低。盡管小鼠在皮下注射150mg/kg紫杉酚水凝膠后，最初的幾天里體重下降，但致命劑量高達300mg/kg，是紫杉酚的7.5倍。在皮下注射紫杉酚水凝膠的劑量高于40mg/kg之后，4～7天內，會對小鼠的皮膚造成傷害，這是由于紫杉酚對所有細胞都有毒性。由此可知，高劑量紫杉酚水凝膠只能用于腫瘤內注射，而不能用于皮下注射，因為紫杉酚水凝膠會對皮下細胞造成損傷，影響病人的身體健康。為了使紫杉酚水凝膠在皮下組織發揮作用，建議用量低于20mg/kg。

3.6 抗腫瘤效果

采用小鼠右側皮下組織的EL-4淋巴瘤動物模型和雌性小鼠4T1-熒光素酶乳腺腫瘤模型。研究紫杉酚水凝膠在體內的抗腫瘤效果，當乳腺腫瘤的體積達到435mm3時，向腫瘤中注射相同體積（50mL），不同劑量（10、20、40mg/kg紫杉酚）的水凝膠。結果顯示，紫杉酚水凝膠可以有效阻止乳腺腫瘤的生長，與相同劑量的紫杉酚相比，抗腫瘤效果更好。

3.7 抑制新陳代謝

直接將紫杉酚水凝膠注入腫瘤，可抑制乳腺癌的新陳代謝?？勺⑸湟欢繜晒馑孛缸鳛榛祝―-熒光素），對體內癌細胞進行定位。與對照組相比，注射紫杉酚水凝膠溶液（10，20和40mg/kg）的小鼠，沒有明顯的新陳代謝過程，說明腫瘤內的癌細胞已經被紫杉酚消滅。

3.8 對體重和血漿濃度的影響

為了研究紫杉酚水凝膠對不同腫瘤的效果，記錄小鼠的體重變化。結果表明采用水凝膠治療的小鼠體重沒有明顯降低，與對照組相比，注射水凝膠劑量低于80mg/kg的小鼠，都保持正常體重。采用體內緩釋給藥時，小鼠血液中紫杉酚濃度較低，說明水凝膠具有較強的生物相容性，緩釋給藥可減小對正常組織的副作用。

4 結論

結果表明，制備的紫杉酚水凝膠，可用于阻止腫瘤生長和新陳代謝；GSSG、PEG等親水性化合物均可用作制備紫杉酚水凝膠的前體；紫杉酚水凝膠在血液中濃度低、抗腫瘤效果好；在化療和臨床應用中都具有很大的發展潛力。

參考文獻

[1]Marupudi NI，Han JE，Li KW，Renard VM，Tyler BM，Brem H.Paclitaxel：a review of adverse toxicities and novel delivery strategies[J].Expert Opin. Drug Saf.，2007，（5）：609.21.

[2]Shen YQ，Jin EL，Zhang B，Murphy CJ，Sui MH，Zhao J，et al.Prodrugs forming high drug loading multifunctional nanocapsules for intracellular cancer drug delivery[J].J Am Chem Soc.，2010，（12）：4259.4265.