拉薩市林周縣甘曲濕地夏、秋季土壤細菌的分離及鑒定

德 吉 李 媛 強久巴姆 其米卓嘎 楊 登

（西藏大學理學院 西藏拉薩 850000）

拉薩市林周縣甘曲濕地夏、秋季土壤細菌的分離及鑒定

德 吉 李 媛 強久巴姆 其米卓嘎 楊 登

（西藏大學理學院 西藏拉薩 850000）

土壤微生物在高原濕地生態系統中具有重要的生態功能。文章在夏、秋兩季對西藏拉薩市林周縣甘曲濕地10個樣點的土壤進行了培養和分離，鑒定出10種不同的細菌，在此基礎上對各樣點間土壤細菌的群落結構差異進行了分析，并針對夏、秋兩季進行了物種多樣性分析。分離到的10種細菌分別為：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissubsp.inaquosorum)，氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)，金黃桿菌屬細菌(Chryseobacterium gambrini)，新鞘氨醇桿菌屬細菌(Novosphingobium capsulatum)，維氏氣單胞菌(Amromonasveronii)，好氧反硝化菌(Pseudomonas chengduensis)和微小桿菌屬細菌(Exiguobacterium artemiae)等9種菌和一種未知菌株。其中，維氏氣單胞菌(Amromonasveronii)是夏、秋兩季的優勢種，維氏氣單胞菌(Amromonasveronii)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissubsp.Inaquosorum)、氧化微桿菌(Microbacterium oxydans)是夏、秋兩季的主要菌株，而嗜根寡氧單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)和金黃桿菌屬細菌(Chryseobacterium gambrini)為夏季特有，新鞘氨醇桿菌屬細菌(Novosphingobium capsulatum)和微小桿菌屬細菌(Exiguobacterium artemiae)為秋季特有。多樣性分析結果表明，夏季1#和4#樣點物種多樣性最豐富，3#樣點多樣性最低，而秋季8#樣點多樣性最豐富，1#最低?？芍?，夏、秋兩季甘曲濕地土壤細菌物種多樣性存在差異。

拉薩；甘曲濕地；土壤；細菌多樣性；夏季；秋季

濕地為介于水生環境和陸地之間十分重要的過渡型環境，具有較豐富的微生物資源，使得濕地生態系統內部及其與鄰近各生態系統之間物質遷移、轉化和循環極其活躍[1]。西藏是中國濕地海拔最高、面積最大、分布最為集中的地區之一，濕地總面積達60042.72km2，約占西藏土地面積的4.9%。西藏濕地類型主要以自然濕地為主，加之該地區人口稀少、經濟開發時間較晚，絕大部分濕地區域受現代工業污染極少，濕地及濕地生物基本上保持著自然原生的狀況[2]。土壤是濕地生態系統的重要組成成分，因此土壤對濕地生態系統的功能及其可持續性方面發揮著重要的作用[3]。土壤的化學性質、物質的轉化和循環利用及污染物的降解等都與土壤微生物息息相關，而細菌是土壤中種類和數量最多的微生物[4]，占土壤微生物總量的70%～90%[5]。研究指出，地上的植被和群落與地下的微生物群落關系緊密，具有正負反饋的相互推動機制[6]。故細菌的重要作用不僅體現在能夠形成和分解有機物、促進植物根系在微生態環境和土壤環境中物質和能量的循環[7-8]，還能夠直接或間接地提高土壤利用效率，實現合理利用土壤。

國內高原微生物及多樣性方面的研究較多，趙墾田、楊小林等[9]對拉薩半干旱河谷土壤砂生槐灌叢恢復過程群落特征與土壤微生物的動態進行了分析。李靜[10]等對西藏15個濕地生態系統中土壤氮循環微生物和多樣性進行了研究。對于西藏甘曲濕地，目前已經有相關的土壤原生動物方面的報道[11]，但該濕地微生物方面的研究較少。近年來，西藏經濟發展逐步加快，諸多地區人流量增加，人類活動區域逐漸擴展甚至已經涉入濕地，導致部分濕地的生態環境及生態系統遭到不同程度的破壞。因此，本文分析了西藏拉薩市林周縣甘曲濕地的土壤微生物多樣性，為濕地微生物群落結構的認識和濕地的合理開發利用提供參考。

1 研究地概況

甘曲濕地海拔3774m，是雅魯藏布江中游河谷的國家級濕地保護區的一部分，位于西藏拉薩市林周縣甘曲鎮巨榮村，為國家Ⅰ級重點保護野生動物黑頸鶴越冬棲息地和其他水禽生存的自然保護區。甘曲濕地占地面積2353畝，植被覆蓋率達80%。植被類型主要為草甸、沼澤和灌木叢。主要植物包括矮嵩草（Kobesia humilis）、海韭菜（Triglochinmaririmum）、蒲公英（Taraxacummongolicum）等。濕地土壤主要為草甸土，地表部分土壤為沙土。該濕地對外開放，全年自由放牧，放牧牲畜主要是牛和驢。

2 材料與方法

2.1 土壤樣品采集

2015年7月，通過實地探察，根據甘曲濕地地理條件、周圍環境和研究方向，將該濕地分為面積相等的十個樣地，并在各樣地中間選取代表性的樣點作為研究對象。記錄各樣點地理位置及土壤狀況，用土壤采集器在每個樣點取0～20cm土層土壤約100g，挑出植物細根、充分混合后用做好標記的封口塑料袋密封，并于采樣當天帶回實驗室并置于4℃的冰箱中貯藏備用。取樣時間分別為2015年7月(夏季)和2015年9月（秋季）。各采樣點概況見表1。

2.2 細菌的分離及純化

制備土壤懸浮液：分別稱取各樣地10g樣品放入裝有90mL無菌水的錐形瓶中，震蕩30min，待土樣與無菌水混合充分后即為10-1土壤懸液；用移液管吸取該懸液1mL于盛有9mL無菌水的試管中，均勻混合后即為10-2土壤懸液；以此類推則可制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同稀釋度的土壤溶液。

接種：用滴管分別取10-6、10-7土壤懸液200μL接于牛肉膏蛋白胨培養基平板上，均勻涂布。每個處理重復3次。

恒溫培養：置于28℃恒溫箱中培養2～3d。

觀察和計數：比較每個樣點的各稀釋度懸液細菌生長狀況，選取菌落長勢較均勻的稀釋度的培養皿，統計各培養皿中菌落數目，觀察并記錄各菌落的形態、大小、顏色、粘稠度、透明度、邊緣情況、隆起狀況、光澤度以及基本顯微特征。

菌株的純化和保藏：菌株的純化采用平板劃線法，將純化好的斜面放置4℃保藏。

2.3 細菌的分類及鑒定

分離純化所得細菌菌株采用經典分類法[12]進行形態學觀察，并將純化菌株送往云南大學微生物研究所，對菌株16SrRNA進行擴增和測序，測序結果在Genbank中進行序列比對分析。

2.4 數據統計及處理分析

統計夏、秋兩季甘曲濕地土壤細菌群落分布，用Excel軟件計算每個樣點各細菌出現頻率、相對豐富度和細菌多樣性指數，細菌多樣性指數采用物種豐富度、細菌總豐度、Pielou均勻度指數（J'）、Shannon Wiener多樣性指數（H′）、Simpson多樣性指數（D）表示，并采用Spss軟件對多樣性指數進行相關性分析,計算各樣點間Jaccard相似性系數。

其中：各細菌出現頻率為各菌株出現的樣點數與總樣點數比值；

相對豐度為實驗區域某種細菌總數與該區域所有細菌總數的比值；物種豐富度為某一樣點菌株種數；

細菌總豐度為某一樣點分離出的細菌總數量（cfu/g）；

Jaccard相似性系數為兩個樣點共有物種數與這兩個樣點物種數的并集的比值；

N為某一樣點細菌總株數；Pi為某一樣點第i種細菌菌株數與該樣點的細菌總株數的比值。

3 結果與分析

3.1 甘曲濕地土壤細菌形態及基本特征

表2結果顯示，甘曲濕地土壤中分離的細菌主要以白色、橙色和黃色為主，并存在一種銀藍色菌株；菌落形態以圓形為主，部分形態不規則；菌株大部分表面光澤且光滑；菌落大多隆起、不透明，存在部分扁平或半透明。10株細菌中，5株為革蘭氏陰性菌，5株為革蘭氏陽性菌；菌株顯微形態以桿狀為主。

表2 甘曲濕地土壤細菌固體培養及顯微形態

表3 甘曲濕地夏季土壤細菌群落組成狀況

3.2 拉薩甘曲濕地夏、秋季土壤細菌群落組成分析

3.2.1 拉薩甘曲濕地夏季土壤細菌菌落組成

表3數據表明，甘曲濕地夏季土壤共分離到6個屬7個種的細菌以及一種未知菌種，其中Amromonas veronii出現頻率高達100%，即該菌在各樣點中均有分布；其次是Microbacterium oxyda和Bacillussubtilis subsp.Inaquosorum，出現頻率分別為80%和70%，即分布較為廣泛，其他種類細菌出現頻率不高，為20%～40%。

夏季甘曲濕地土壤細菌中，Amromonasveronii相對豐度最高（41.82%），其次為Bacillussubtilissubsp.Inaquosorum和Microbacterium oxydans，相對豐度分別為28.41%和23.18%，Chryseobacterium grambrini和Bacillus thuringensis相對豐度分別為4.29%和1.5%，而Pseudomonaschengduensis和Stenotrophomonasrhizophila雖然在2～3個樣點中均有分布，但相對豐度較低。綜合分析可知，甘曲濕地夏季土壤細菌的優勢菌種為Amromonasveronii。

3.2.2 甘曲濕地秋季土壤細菌菌落組成

表4數據表明，從秋季甘曲濕地土壤中分離的細菌為6個屬7個種及一個未知菌種。Amromonasveronii出現頻率最高（70%），即該菌分布最廣泛，在7個樣點中均有分布；其次是Bacillus thuringensis和Exiguobacterium artemiae，出現頻率均為60%，Bacillussubtilissubsp.Inaquosorum和Microbaterium oxydans分布也較廣泛，在該濕地的5個樣點中均有分布，而Pseudomonaschengduensis和Novosphingobium capsulatum稍次之，出現頻率均為30%。

甘曲濕地秋季土壤中Amromonasveronii、Microbaterium oxydans和Bacillussubtilissubsp.Inaquosorum相對豐度分別為33.0%、30.69%和22.82%。Novosphingobium capsulatum相對豐度為6.46%，Bacillus thurin-gensis相對豐度為4.87%，這兩種菌分布較廣泛，但在各樣點中可培養菌株數量較少，故相對豐度稍低；而Exiguobacterium artemiae、Pseudomonaschengduensi和Bacillus thuringensis及未知菌種相對豐度均在0.39%～0.81%范圍內，其中Pseudomonaschengduensis相對豐度最低，為0.39%。

表4 甘曲濕地秋季土壤細菌群落分布

表5 甘曲濕地夏季土壤各樣點細菌Jaccard相似性系數

綜合表3和表4可知，秋季和夏季甘曲濕地的優勢細菌種均為Amromonasveronii。Stenotrophomonas rhizophila和Chryseobacterium gambrini為夏季特有，Novosphingobium capsulatum和Exiguobacterium artemiae為秋季特有。

3.3 甘曲濕地夏、秋季土壤各樣點細菌群落結構相似性分析

表5數據顯示，甘曲濕地夏季各樣點間Jaccard相似性系數為0.14～1。不同樣點間最高相似性系數為0.8，為4#和5#樣點間，5#和8#樣點、8#和10#樣點相似性系數達到0.75，以上均屬極度相似；Jaccard相似性系數最低為0.14，為2#和6#樣點之間；3#分別與11#、4#、6#樣點間的相似性系數介于0～0.25，即極度不相似?？偟膩碚f，0.5～0.75范圍內的相似性系數最廣泛，約占53.3%，屬于中等相似。

從表6可以看出，甘曲濕地秋季土壤各樣點細菌相似性系數在0和1之間。其中，4#和8#、5#和7#、6#和8#間Jaccard相似性系數最高，為0.6，屬中等相似；1#和9#、1#和10#、2#和9#、3#和10#間相似性系數為0?？偟膩碚f，秋季各樣點間相似性系數約為50%，介于0.25～0.5，即屬于中等不相似。

3.4 甘曲濕地夏、秋季土壤細菌多樣性指數分析

表7結果表明，1#樣點物種最豐富，有6種細菌，其次是4#、6#、7#物種豐富度均為5；7#樣點細菌總豐度最高，其次是5#和8#；1#樣點Simpson多樣性指數（D）最高（0.7326），即物種多樣性最豐富，而4#樣點ShannonWiener多樣性指數(H′)和Pielou均勻度指數(J')最高，即該樣點群落最復雜，分別為1.9430和0.2770。綜合各多樣性指數，1#和4#樣點種群最豐富，群落穩定性最強。5#、6#、7#樣點多樣性也較豐富，而3#樣點群落組成單一，只存在一種菌株，即維氏氣單胞菌Amromonasveronii，故ShannonWiener多樣性指數(H′)、Pielou均勻度指數(J')和Simpson多樣性指數（D）最低，均為0。

表6 甘曲濕地秋季土壤各樣點細菌Jaccard相似性系數

表7 甘曲濕地夏季土壤細菌多樣性指數

表8結果顯示，甘曲濕地秋季土壤中，3#樣點物種豐富度最高，為5；5#樣點細菌總豐度最高；8#樣點物種多樣性最豐富，群落最復雜，穩定性最強。和夏季多樣性指數相比較，1#樣點物種豐富度和細菌總豐度均有所減少，且多樣性指數降為最低。

表8 甘曲濕地秋季細菌多樣性指數

表9 甘曲濕地夏季土壤細菌多樣性指數Pearson相關性分析

表10 甘曲濕地秋季土壤細菌多樣性指數Pearson相關性分析

3.5 甘曲濕地夏、秋季土壤細菌多樣性指數相關性分析

Pearson相關性分析表明(見表9），甘曲濕地夏季土壤細菌物種豐富度與J'和D存在極顯著正相關性（P＜0.01）；而Pielou均勻度指數(J')與Simpson多樣性指數（D）則顯著正相關（P＜0.05）。

表10結果顯示，甘曲濕地秋季土壤細菌物種豐富度與細菌總豐度、Pielou均勻度指數影響均不顯著，與ShannonWiener多樣性指數(H′)、Simpson多樣性指數（D）則呈顯著正相關（P＜0.05）；Shannon Wiener多樣性指數、Pielou均勻度指數(J')、Simpson多樣性指數（D）之間兩兩極顯著正相關（P＜0.01）。

4 結論

對夏季和秋季分離自甘曲濕地土壤細菌進行分子鑒定，將其歸為10種，主要包括Bacillussubtilis sub sp.Inaquosorum，Microbacterium oxydans，Bacillus thuringiensis，Stenotrophomonas rhizophila，Chryseobacterium gambrini，Novosphingobium capsulatum，Amromonas veronii，Pseudomonas chengduensis和Exiguobacterium artemiae等9種菌和一種未知菌株。其中Amromonasveronii是夏、秋兩季的優勢種，Amromonasveronii、Bacillus subtilis subsp.Inaquosorum、Microbacterium oxydans是夏、秋兩季的主要菌株，而S tenotrophomonas rhizophila和Chryseobacterium gambrini為夏季特有，Novosphingobium capsulatum和Exiguobacterium artemiae為秋季特有。

5 討論

本研究對夏、秋兩季拉薩甘曲濕地進行設點，培養、分離并鑒定出該濕地土壤細菌，比較分析各樣點間群落結構差異和夏、秋兩季多樣性差異。作為同一試驗地的10個樣點，在夏、秋兩季的研究中，1#、3#、6#等樣點的群落結構和多樣性指數出現明顯差異，這可能由于細菌主要類群的種類與數量在不同季節存在差異，導致不同季節相同樣點細菌多樣性指數存在差異。另外，在植物生長旺盛的夏季，植物的根系分泌物對土壤環境產生影響[13]，而秋季少量植物凋零進入土壤，改變了微生物可利用底物的組成（與夏季旺盛的植物根系代謝物相比可能更單一），從而導致土壤細菌的群落結構產生較明顯的變化。除此之外，西藏獨有的高原氣候、高原生境，以及該濕地常有牛、驢群等放牧，不同時間不同動物和人類的頻繁活動及牲畜代謝物很大程度上也直接影響該濕地表層土壤微生物群落的多樣性。

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Isolation and identification ofbacteria in soilofGanquWetland in summer and autumn at Linzhou County,Lhasa

Deji LiYuan Qiangjiu Baimu QimiZhuoga Yang Deng
(Schoolof Science,TibetUniversity,Lhasa 850000,Tibet)

Soilmicroorganism has an importantecological function in thewetland ecosystem in the Tibetan Plateau.Soil bacteria were isolated by using the dilution method and purified from 10 soil samples in Ganqu wetland.The results showed that the 10 isolated bacteria can be classified into 8 species,including Bacillus subtilis subsp.Inaquosorum，Microbacterium oxydans，Bacillus thuringiensis，Stenotrophomonas rhizophila,，Chryseobacterium gambrini，Novosphingobium capsulatum,Amromonas veronii,Pseudomonas chengduensis,Exiguobacterium artemiaeand one unknownstrain.Amromonas veroniiwasdominant in both summerand autumn,while Stenotrophomonas rhizophila and Chryseobacterium gambriniwere special in summer,and Novosphingobium capsulatumand Exiguobacterium artemiaewere only found in autumn samples.Diversity analysis indicated that the summer samples 1#and 4#havemost abundant species,the species abundance in sample 3#was relatively low, while species abundancewas in autumn sample 8#was high and low in sample 1#.The species diversity of soil bacteriawasdifferent in summerand autumn samples in Ganquwetland.

Lhasa;GanquWetland;soil;bacteria diversity;summer;autumn

10.16249/j.cnki.54-1034/c.2016.02.002

S153.6

A

1005-5738（2016）02-010-008

[責任編輯：張建偉]

2016-08-19

2016年度西藏自治區自然科學基金項目“西藏拉魯濕地水體酵母菌多樣性及其與環境因子相關性研究”（項目號：2016ZR-15-11）；2014年度國家級大學生創新創業訓練項目“拉薩市河谷微生物群落研究”（項目號：2014XCX002）；2016年度西藏大學珠峰學者人才發展支持計劃（項目號：藏大字[2016]141號）階段性成果。

德吉，女，藏族，西藏日喀則人，西藏大學理學院講師，主要研究方向為微生物生態學。